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Jan 07, 2024

Verwertung von Reisstroh, Zuckerrohr-Bagasse und süßer Sorghum-Bagasse zur Herstellung von Bioethanol und Phenylacetylcarbinol

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 727 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die offene Verbrennung landwirtschaftlicher Rückstände verursacht zahlreiche Komplikationen, darunter Feinstaubverschmutzung in der Luft, Bodendegradation, globale Erwärmung und vieles mehr. Da sie über ein Bioumwandlungspotenzial verfügen, wurden für die Studie agroindustrielle Rückstände wie Zuckerrohrbagasse (SCB), Reisstroh (RS), Maiskolben (CC) und süße Sorghumbagasse (SSB) ausgewählt. Hefestämme, Candida Tropicalis, C. Shehatae, Saccharomyces Cerevisiae und Kluyveromyces Marxianus Var. marxianus wurden hinsichtlich ihres Produktionspotenzials von Bioethanol und Phenylacetylcarbinol (PAC) verglichen, einem Zwischenprodukt bei der Herstellung wichtiger Arzneimittel, nämlich Ephedrin und Pseudoephedrin. Unter den untersuchten Substraten und Hefen erzeugte RS, kultiviert mit C. Tropicalis, nach 24-stündiger Kultivierung eine signifikant (p ≤ 0,05) höhere Ethanolkonzentration von 15,3 g L−1. Die Produkt-pro-Substrat-Ausbeute (Yeth/s) betrug 0,38 g g-1 mit einer volumetrischen Produktivität (Qp) von 0,64 g L-1 h-1 und einer Fermentationseffizienz von 73,6 %, basierend auf einer theoretischen Ausbeute von 0,51 g Ethanol/g Glucose . In RS-Medium gezüchteter C. Tropicalis produzierte 0,303 U mL-1 Pyruvatdecarboxylase (PDC), ein Schlüsselenzym, das die Produktion von PAC katalysiert, mit einer spezifischen Aktivität von 0,400 U mg-1 Protein nach 24-stündiger Kultivierung. In dieser vorliegenden Studie wurde auch die gesamte Zellbiomasse von C. Tropicalis mit seinem teilweise gereinigten PDC-Präparat für die PAC-Biotransformation verglichen. Die gesamten C. Tropicalis-PDC-Zellen erzeugten bei 1,29 U mL−1 eine Gesamtkonzentration von 62,3 mM PAC, was im Vergleich zur teilweise gereinigten Enzympräparation um 68,4 % höher war. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verwertung von Lignozelluloserückständen in Bioethanol und PAC nicht nur dazu beitragen wird, die Umweltbelastung durch ihre Umgebung zu mindern, sondern auch das Potenzial hat, die Bioökonomie zu verbessern.

Da die Weltbevölkerung Schätzungen zufolge bis 2050 auf über 9 Milliarden und bis 21001 auf 11 Milliarden anwachsen wird, ist die ausreichende Nahrungsmittelversorgung in naher Zukunft fraglich. Um dieses Problem zu lösen, nutzt die wissenschaftliche Gemeinschaft verschiedene Strategien zur Verhinderung des Verderbens von Lebensmitteln2,3 und zur Verlängerung ihrer Haltbarkeit4,5 und versucht gleichzeitig, nützliche Mikroben für die Lebensmittelindustrie zu identifizieren6. Im Hinblick auf das Ziel 2 der nachhaltigen Entwicklung (Kein Hunger) gab es bemerkenswerte Fortschritte in der Geflügel-, Vieh- und Pflanzenproduktion, die zusätzlich zur Entstehung von Lebensmittel- und Agrarabfällen beitragen7. Lebensmittelabfälle können zu kommerziell nutzbaren Produkten recycelt werden, beispielsweise werden sie neben der Gewinnung von Mehrwertkomponenten auch als Rohstoffe für die Herstellung von Biokunststoffen und Biokraftstoffen genutzt8. Lebensmittelabfälle werden auch in industriellen Prozessen zur Herstellung von Biokraftstoffen oder Biopolymeren eingesetzt9,10. Andererseits können agroindustrielle Rückstände für die Energiegewinnung aus Biomasse, die Pilzproduktion, die Karton-/Papierproduktion und andere außerlandwirtschaftliche Anwendungen verwendet werden11. Obwohl sie für die Herstellung wertvoller Produkte wie Spanplatten, Spanplatten, Bioverbundwerkstoffe12 oder andere Baumaterialien13 recycelt werden können, beträgt die Menge an Reststoffen, die diese Alternativen derzeit verwenden können, nur einen Bruchteil dessen, was tatsächlich produziert wird11. In vielen Ländern werden diese riesigen Mengen an Rückständen mangels angemessener Bewirtschaftungs- und Verwertungspraktiken derzeit verbrannt oder unter der Erde vergraben, was zu Luft- und Wasserverschmutzung und globaler Erwärmung führt14. Das Verbrennen von Rückständen im Freien trägt zur Feinstaubbelastung bei, einem wichtigen Gesundheitsrisikofaktor, der in mehreren Regionen der Welt, einschließlich Südostasien, erheblich zur Sterblichkeit beiträgt. Im Jahr 2019 wurde in einer Global Burden of Disease (GBD)-Studie die PM2,5-Exposition als sechster globaler Mortalitätsrisikofaktor eingestuft15. Das Ausmaß der Verbrennung landwirtschaftlicher Abfälle und ihre katastrophalen Folgen für die Luftqualität werden in Thailand, einem großen Agrarproduzenten in Südostasien, als siebtgrößter Sterblichkeitsrisikofaktor15,16,17 eingestuft. Diese unsachgemäße Bewirtschaftung hat zu einem intensiven Bedarf an der Entwicklung von Strategien für die rechtzeitige Nutzung und Verwertung landwirtschaftlicher Reststoffe im Hinblick auf Nachhaltigkeit sowie Ernährungs- und Gesundheitssicherheit geführt14.

Da es sich bei Ernterückständen und agroindustriellen Abfällen um lignozellulosehaltige Biomasse handelt, die aus Zellulose, Lignin und Hemizellulose besteht, können sie anstelle der Verbrennung für die Produktion von grüner Energie und Mehrwertprodukten18 verwendet werden. Ein Bioraffinerie-Ansatz ist ein kohärenter und praktikabler Ersatz für die Synthese verschiedener Bioprodukte aus Lignozellulose-Biomasse. Sie bestehen überwiegend aus Cellulose, Hemicellulose und Lignin19, die entweder chemisch oder enzymatisch hydrolysiert werden können, um fermentierbare Zucker, Glucose bzw. Xylose, sowie L-Arabinose20,21 zu ergeben. Im Konzept der Bioraffinerie können wir durch anaerobe Vergärung, Fermentation und Kompostierung die reichlich vorhandene Abfallbiomasse in Bioraffinerieprodukte wie Biokraftstoffe, Biodünger, Biokunststoffe, Enzyme, organische Säuren und andere Mehrwertchemikalien umwandeln22,23,24. Zuckerrohr-Bagasse, Reisstroh, Maiskolben und Sorghum-Bagasse, die am häufigsten von der Agrarindustrie in großen Mengen jährlich anfallende Abfallbiomasse, sind geeignete Materialien für die Umwandlung durch Bioraffinerien in Mehrwertprodukte.

Im aktuellen Szenario arbeitet die wissenschaftliche Gemeinschaft intensiv an der Suche nach alternativen, nachhaltigen und umweltfreundlichen Energiequellen zur Bekämpfung des hohen Energiebedarfs. Bioethanol ist eine der am besten geeigneten erneuerbaren, alternativen Energiequellen, um fossile Brennstoffe zu ersetzen. Daher sind Forscher aktiv an der Herstellung von Bioethanol durch mikrobielle Fermentation aus kostengünstigen Abfällen wie Lignozellulose25,26 beteiligt, da diese nicht nur reichlich vorhanden sind, sondern auch nicht mit der Lebensmittelproduktion konkurrieren und somit die Ernährungssicherheit nicht beeinträchtigen. In dieser Hinsicht kann eine Bioraffinerie systematisch betrieben werden, um eine Null-Abfall-Produktion27 zu erreichen, indem neben Bioethanol auch Chemikalien mit hoher Wertschöpfung hergestellt werden, da dadurch auch die Rentabilität des Bioprozesses erhöht wird.

Pyruvatdecarboxylase (PDC) ist ein Schlüsselenzym, das an der Bioethanolproduktion beteiligt ist, indem es Pyruvat durch eine Decarboxylierungsreaktion in Acetaldehyd und Kohlendioxid katalysiert28. PDC führt neben der Decarboxylierung auch eine Carbolisierungsreaktion durch, bei der es eine Kohlenstoffbindung von Benzaldehyd in den aktiven Acetaldehyd überbrückt, was zur Produktion von R-Phenylacetylcarbinol (PAC) führt, einem wichtigen Vorläufer bei der Herstellung von Arzneimitteln, nämlich Ephedrin und Pseudoephedrin. Ephedrin und Pseudoephedrin werden zur Vorbeugung oder Linderung von mit Asthma verbundenem Keuchen eingesetzt29, zur Linderung von niedrigem Blutdruck während einer Spinal- oder Epiduralanästhesie30, bei der Behandlung und Behandlung klinisch signifikanter Hypotonie31 und wirken als abschwellendes Mittel, das eine verstopfte Nase reduziert32. Aus der Literatur geht auch klar hervor, dass es sich bei Ephedrin um ein Arzneimittel mit mehreren Adrenalinwirkungen handelt, das bei der Behandlung von Fettleibigkeit und in der Sportmedizin eingesetzt wird33. Viele Forscher haben in jüngster Zeit auch berichtet, dass das Medikament Ephedrin ein klinischer neuroprotektiver Kandidat für die Behandlung von zerebralem ischämischem Schlaganfall34 und Hirnverletzungen35 sein könnte. Außerdem könnte Ephedrin schützende Wirkungen gegen chronisch obstruktive Lungenerkrankungen haben36 und eines der Standardmittel für vasopressive Wirkstoffe sein, um die Folgen lebensbedrohlicher Krankheiten wie Infektionen, Herzversagen und Anaphylaxie bei chirurgischen Eingriffen auszugleichen37,38. Aufgrund seiner bedeutenden Bedeutung im medizinischen Bereich wird das Medikament Ephedrin in der 21. Ausgabe der Musterliste der unentbehrlichen Arzneimittel der WHO aufgeführt39. Solche jüngsten Entwicklungen im medizinischen Bereich zeigen, dass Ephedrin potenzielle Anwendungen im Pharmasektor hat und dass sein weltweiter Markt voraussichtlich erheblich wachsen wird und auch in Zukunft eine bedeutende Rolle in der Pharmaindustrie sowie in der öffentlichen und primären Gesundheitsversorgung spielen wird. In dieser Hinsicht erfolgt die kommerzielle Produktion von PAC, der Vorstufe von Ephedrin, deren Wert auf 146 USD/kg geschätzt wird40, durch Decarboxylierung von Pyruvat und anschließende Carbolisierung von Benzaldehyd41 durch Übertragung von enzymgebundenem „aktivem Acetaldehyd“ auf Benzaldehyd über ein Nukleophil Zusatz42.

Verschiedene Arten von Hefen, Pilzen und Bakterien wurden von mehreren Forschern für den oben genannten Biotransformationsprozess genutzt43,44,45,46. In einer von Rosche et al.47 durchgeführten Studie wurden 105 Hefestämme auf PAC-Produktion und drei Arten von Candida sp. wurden als die interessantesten Kandidaten identifiziert, da sie eine höhere PAC bei geringer Inaktivierung durch Benzaldehyd und Acetaldehyd erzeugten. Dieselben Autoren berichteten in einer anderen Studie, dass Rhizopus javanicus ein potenzieller Produzent von PAC unter 14 ethanolproduzierenden Pilzen sei, basierend auf höherem Ertrag und schnellem Wachstum48. In ähnlicher Weise wurden in unserer früheren Forschung 50 Mikrobenstämme auf die Produktion von Ethanol und PAC untersucht und die Ergebnisse zeigten, dass C. Tropicalis anderen Stämmen überlegen war49. In einer anderen von Miguez et al.45 berichteten Studie wurden Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae und S. pastorianus als beste Produzenten für die PAC-Produktion ausgewählt. Was die Produktion von Ethanol und PAC in einem integrierten Prozess betrifft, hängt die Auswahl geeigneter Mikrobenstämme für die PAC-Produktion nicht nur von einem höheren Ertrag und einer Toleranz gegenüber Benzaldehyd-Toxizität ab, sondern auch von ihrer Fähigkeit, die in der Landwirtschaft verfügbaren Kohlenstoffquellen zu nutzen -Industrielle Rückstände, die in der Lage sind, nennenswerte Mengen an Ethanol und Biomasse zu produzieren. Somit wurden in der vorliegenden Untersuchung vier Hefestämme, C. Tropicalis TISTR 5306, C. Shehatae TISTR 5843, S. Cerevisiae TISTR 5606 und K. Marxianus Var. marxianus TISTR 5057 wurden für die detaillierte Studie berücksichtigt. Der Grund für die Auswahl von C. Tropicalis TISTR 5306 und S. cerevisiae TISTR 5606 war, dass diese Stämme in unseren früheren Studien eine gute Leistung bei der Produktion von Ethanol und PAC erbrachten50,51. C. shehatae TISTR 5843 und K. marxianus var. marxianus TISTR 5057 wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, Pentosezucker zu konsumieren, in diese Studie einbezogen.

Obwohl bereits früher über mehrere Forschungsdaten zur Herstellung von Ethanol aus agroindustriellen Rückständen berichtet wurde, ist dies die erste Studie dieser Art, die verschiedene agroindustrielle Rückstände bei der gleichzeitigen Produktion von Bioethanol und PDC-Enzym bewertet. Die Studie untersuchte auch den Einfluss der Biomasse ganzer Zellen und teilweise gereinigter PDC-Enzyme auf die PAC-Produktion in einem Doppelschicht-Biotransformationssystem. Bei diesem Bioraffinerie-Ansatz werden die in den Rohstoffen vorhandenen Zucker als Kohlenstoffquelle für Ethanol genutzt, und die bei der Fermentation erzeugte PDC-haltige Biomasse könnte für die Synthese von PAC verwendet werden. Die Integration der Produktion von PAC und Bioethanol wird die Gesamtrentabilität und Produktivität beider Produkte verbessern. Daher wurden in der vorliegenden Studie Experimente zur Auswahl geeigneter Rohstoffe und Hefestämme für eine optimale Ethanol- und PDC-Produktion sowie Biotransformationsstudien zur Bewertung der PAC-Synthese konzipiert.

Landwirtschaftliche und agroindustrielle Abfallmaterialien, darunter Maiskolben (CC) und Reisstroh (RS), erhalten vom Chiang Mai Provincial Livestock Office, Zuckerrohrbagasse (SCB) von Kaset Thai International Sugar Corporation und süße Sorghum-Bagasse (SSB) von einem örtlichen Bauernhof in Saraphi District wurden zweimal mit fließendem Leitungswasser gewaschen und 24 Stunden lang in der Sonne getrocknet. Alle landwirtschaftlichen Materialien außer CC wurden in kleine Segmente (ca. 1–3 cm Länge) gehackt, während CC in kleine Körner (ca. 0,3–0,5 cm Durchmesser) zerrieben und trocken bei 25 °C gelagert wurde. Cellulase aus Trichoderma reesei wurde von Vland Biotech Group Co. Ltd, China, bezogen. Die Cellulaseaktivität wurde mit der von Ghose52 beschriebenen Methode bestimmt, wobei die anfängliche volumetrische Enzymaktivität vor der Studie 103 ± 3 FPU ml−1 betrug. Der R-PAC-Standard (basierend auf der Fischer-Projektion – eine absolute Konfiguration, die dem L-PAC entspricht) wurde von Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada, bezogen. Alle anderen Standardchemikalien und Zucker wurden von Sigma-Aldrich/Merck, Burlington, MA, USA, bezogen. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Lösungsmittel waren analysenrein.

Ethanolproduzierende Hefen, die vom Thailand Institute of Scientific and Technological Research (TISTR), Bangkok, Thailand, bezogen wurden, waren C. Tropicalis TISTR 5306, C. Shehatae TISTR 5843, S. Cerevisiae TISTR 5606 und K. Marxianus Var. marxianus TISTR 5057. Die Stammlösung wurde in 80 % (v/v) Glycerin bei –20 °C gehalten53. Hefen wurden auf Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD)-Agar (Hefeextrakt 10 g L-1, Pepton 10 g L-1, Agar 20 g L-1 und Glucose 20 g L-1) kultiviert und anschließend in YPD-Brühe bei 30 °C gezüchtet °C, 250 U/min für 24 Stunden und auf Lebensfähigkeit der Zellen untersucht. Die Zählung der Hefezellen wurde mit einem Hämozytometer (Count Chamber, Modell: PM MFR 650030, Haryana, Indien) durch Anfärben mit 0,1 % (w/v) Methylenblau durchgeführt, um lebende und tote Zellen zu unterscheiden, wie von Borzani und Vario54 beschrieben. Alle Hefestämme hatten eine Anzahl lebensfähiger Zellen von > 95 % und wurden als Starterkultur mit 10 % (v/v) Beimpfung verwendet55.

Die Rohstoffe wurden vorbehandelt, indem sie bei 6,20 % (Gew./Vol.) entweder in destilliertem Wasser oder einer Calciumhydroxidlösung (1,84 % G/V) suspendiert und 4 Stunden lang bei 100 °C inkubiert wurden. Die Auswahl von Calciumhydroxid für die Vorbehandlung basierte auf den Ergebnissen unserer vorherigen Forschung, bei der Vorbehandlungsstrategien zwischen Calciumhydroxid, Schwefelsäure, Natriumhydroxid und Wasserstoffperoxid mit den optimalen Ergebnissen hinsichtlich Gesamtzuckerkonzentration, Ausbeute und Produktionskosten verglichen wurden ( unveröffentlichte Daten). Darüber hinaus wurden die Vorteile der Vorbehandlung mit Calciumhydroxid aufgezeigt und erfolgreich auf andere Studien unserer Gruppe angewendet56. Als Vergleichskontrolle diente die Vorbehandlung mit destilliertem Wasser. Die durch Filtration gewonnenen vorbehandelten Materialien wurden in Wasser gewaschen und mit Natriumacetatpuffer (50 mM, pH 4,8) im Verhältnis 1:5 (Feststoff:Flüssigkeit) suspendiert. Ein vorläufiges Experiment bestehend aus unterschiedlichen Feststoff-Flüssigkeits-Verhältnissen wurde hinsichtlich der Zuckerausbeute während der Vorbehandlungsmethode verglichen und das Feststoff-Flüssigkeits-Verhältnis von 1:5 erwies sich als ideal, was zu einer höheren Freisetzung von Zuckern führte (unveröffentlichte Daten). Die enzymatische Hydrolyse vorbehandelter Materialien wurde durch Zugabe von Cellulase-Enzym (10 % v/v) bei 50 °C für 48 Stunden unter Schüttelbedingungen bei 200 U/min durchgeführt, wie von Wattanapanom et al.56 beschrieben. Das Hydrolysat wurde mit einem doppellagigen Musselintuch filtriert, um grobe unlösliche Stoffe zu entfernen. Die mögliche Beeinträchtigung durch unlösliche Feinpartikel, die zu Beginn der mikrobiellen Kultivierung dem Musselin-Filtrationsprozess entgangen sind, bei der Bestimmung der Konzentration getrockneter Biomasse zu einem bestimmten Zeitpunkt konnte durch eine Offsetberechnung der ermittelten Werte relativ zu denen zum Zeitpunkt Null beseitigt werden. Die Art und Konzentration der Zucker im Hydrolysat nach der enzymatischen Hydrolyse wurden mittels HPLC analysiert. Die drei Substrate mit der höchsten Gesamtzuckerausbeute wurden für das nächste Experiment ausgewählt.

Da im vorherigen Abschnitt der Vorbehandlung und enzymatischen Verzuckerung gezeigt wurde, dass CC einen relativ geringeren Gesamtzuckergehalt aufweist, wurde es während des Auswahlverfahrens eliminiert. Das Experiment wurde eingerichtet, um den Einfluss von Substraten (SCB, RS und SSB) auf das mikrobielle Wachstum und die Ethanolproduktion unter Verwendung von C. Tropicalis zu bewerten. Die Kultivierungsbedingungen ähnelten denen, die zuvor von Nunta et al.51 beschrieben wurden. Kurz gesagt, ein 10 ml Saatgut-Inokulum aus Glycerinstamm wurde in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben mit 90 ml Hydrolysat, ergänzt mit Ammoniumsulfat (8,52 g L−1) als Stickstoffquelle, bei 250 U/min, 30 °C und Probenahmeintervallen von 0,5 °C gezüchtet. 24 und 48 Stunden in dreifacher Ausfertigung. Die Score-Ranking-Methodik wurde von Nunta et al.51 und Tangtua et al.49 übernommen, um das am besten geeignete Substrat für weitere Experimente zu bewerten. Der höchste Wert der Rohdaten unter Berücksichtigung aller Wiederholungen für jedes Kriterium, wie anfänglicher Gesamtzucker, Ethanol und Konzentration an getrockneter Biomasse, wurde einem Wert von 100 zugeordnet und die anderen nachfolgenden Werte wurden dann proportional auf die gleiche Skala umgerechnet.

In diesem Experiment wurden die Hefen C. Tropicalis, C. Shehatae, S. Cerevisiae und K. Marxianus auf die Produktion von Biomasse, Ethanol und PDC-Aktivität auf dem ausgewählten Substrat aus dem obigen Abschnitt untersucht. Das Saatgut-Inokulum wurde hergestellt, indem Hefen in 50 ml Hefekulturmedium in 250-ml-Erlenmeyerkolben beimpft und 24 Stunden lang bei 30 ± 1 °C bei 250 U/min inkubiert wurden. Das Kultivierungsmedium aus 450 ml Hydrolysat mit zugesetztem Ammoniumsulfat (8,52 g L−1) als Stickstoffquelle wurde mit 10 % (v/v) Saatgutinokulum in einen 1-l-Erlenmeyerkolben überführt und 48 Stunden lang bei 30 °C bei 250 U/min inkubiert ± 1 °C49. Wie in unserer früheren Forschung beobachtet51, bieten diese Kultivierungsbedingungen eine anfängliche aerobe Umgebung, die ausreicht, um genügend Zellbiomasse zu produzieren und einen teilweise aeroben Zustand für die anschließende Ethanolproduktion und PDC-Aktivität zu initiieren. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Proben wurden nach 0, 24 und 48 Stunden entnommen, um den Zuckerverbrauch sowie die Produktion von Ethanol, getrockneter Biomasse und PDC-Aktivität zu bewerten. Die zugehörigen kinetischen Parameter wurden auch in zwei Intervallen von 0–24 und 24–48 Stunden bestimmt. Die Score-Ranking-Strategie wurde verwendet, um die geeignete Hefe mit ausgewähltem Substrat für nachfolgende Biotransformationsstudien zu bewerten.

Biotransformationsstudien wurden wie von Leksawasdi et al.57 und Gunawan et al.58 beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Die vorgefrorene feuchte Biomasse von C. Tropicalis wurde bei einer Gesamtzellkonzentration von 12,24 g/l mit einer anfänglichen volumetrischen PDC-Aktivität von 1,29 ± 0,12 U mL/1 hergestellt. Das teilweise gereinigte PDC (0,32 ± 0,04 U mL−1) wurde ebenfalls hergestellt und aus 12,24 g L−1 feuchter Biomasse basierend auf einer zuvor veröffentlichten Strategie55 extrahiert. Die feuchte Biomasse oder teilweise gereinigte PDC als Biokatalysatoren wurden dem zweiphasigen System zugesetzt, das aus einer wässrigen Phase bestehend aus 125 ml 1 M Phosphatpuffer (pH 6,4/1 M H3PO4), Pyruvat (240 mM), Thiaminpyrophosphat (1 mM) und … bestand Magnesiumheptahydrat (1 mM) und eine organische Phase bestehend aus 125 ml Pflanzenöl mit Benzaldehyd (200 mM)59. Die Biotransformation wurde durch Rühren der Mischung zur Bildung einer Emulsion aus Öltröpfchen in der wässrigen Phase bei 10 °C für 6 Stunden eingeleitet. Der Biotransformationsprozess wurde unter aeroben Bedingungen durchgeführt, es sollte jedoch beachtet werden, dass der Sauerstoff nicht am PAC-Produktionsprozess beteiligt war, der auf Decarboxylierung und Carbolisierung am aktiven Zentrum von PDC beruhte. Darüber hinaus handelte es sich bei den in der aktuellen Studie verwendeten Biokatalysatoren nicht um lebende ganze Zellen im Wachstums- oder Kultivierungsstadium. Proben aus Öl- und wässrigen Phasen wurden bei 0, 5, 30, 60, 120, 180, 240, 300 und 360 Minuten in fünffacher Ausführung entnommen und vor der Zentrifugation bei 2822 × g mit Trichloressigsäure (10 % (Gew./Vol.)) versetzt 5 Minuten, um die Phasen für weitere Analysen zu trennen.

Zur Schätzung der getrockneten Biomasse wurde zunächst das Trockengewicht der unlöslichen Stoffe im Hydrolysat vor der Beimpfung durch Trocknen in einem Heißluftofen (Daihan Lab Co., Ltd., Gangwon, Korea) bei 105 °C gemessen, bis ein konstantes Gewicht erreicht wurde . Nach der Inokulation wurden in Abständen (0, 24 und 48 Stunden) gesammelte Proben 15 Minuten lang bei 2822 × g zentrifugiert (Nuve, Modell Nr. NF 200, Ankara, Türkei), um Überstand und Pellet zu trennen. Das Pellet wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und auf sein Gesamttrockengewicht analysiert, das unlösliche Stoffe und das Gewicht der Biomasse umfasst. Das anfängliche Trockengewicht der unlöslichen Substanz wurde von diesem Gesamttrockengewichtswert abgezogen, um das tatsächliche Trockengewicht der Biomasse zu bestimmen60. Der Überstand wurde auf pH-Wert, gesamte lösliche Feststoffe (TSS), Zucker (Cellobiose, Glucose, Xylose, Arabinose), Ethanol und Essigsäurekonzentration analysiert. Der pH-Wert wurde mit einem digitalen pH-Meter (Eutech Instruments, Modell pH 510, Nijkirk, Japan) gemessen und der TSS (°Brix) wurde mit einem Handrefraktometer (Atago, Modell Nr. N-1α, Tokio, Japan) bestimmt. . Zucker-, Ethanol- und Essigsäurekonzentration wurden mittels HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien) analysiert, wie von Khemacheewakul et al.61 beschrieben, unter den folgenden Bedingungen: 5 mM Schwefelsäure in destilliertem Wasser als mobile Phase mit Aminex® HPX-87H Ion Exklusiver Säulen- und Brechungsindexdetektor (RID) bei einer Durchflussrate von 0,75 ml min−1. Die Temperatur des Säulenofens wurde auf 40 °C eingestellt. Kinetische Parameter wie die volumetrische Produktivität von Ethanol (Qp), die spezifische Gesamtzuckerverbrauchsrate (qs,tot), die spezifische Wachstumsrate (µ), die Ausbeute an erzeugtem Ethanol im Verhältnis zur Gesamtmenge an verbrauchten Zuckern (Yeth/s), die Ausbeute an produzierter Essigsäure im Verhältnis zur Gesamtmenge Der verbrauchte Zucker (Yace/s) und der Ertrag der produzierten getrockneten Biomasse im Vergleich zum gesamten verbrauchten Zucker (Yx/s) wurden auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Arbeiten berechnet51,53. In ähnlicher Weise wurde die Fermentationseffizienz (FE%) unter Verwendung der etablierten Formel basierend auf Glucose62 berechnet und im ergänzenden Abschnitt gezeigt.

Zur Herstellung von teilweise gereinigtem PDC wurde ein Teil der feuchten Hefebiomasse (12,24 g), die aus der obigen Kultivierung nach 48 Stunden auf 1-L-Basis gewonnen wurde, wie von Tangtua et al.63 beschrieben, verwendet. Kurz gesagt wurde die Biomasse zu Citratpuffer (200 mM, pH 6,0) mit Glaskügelchen (425–600 μm) im Verhältnis 1:1 (Gew./Gew.) zu Hefezellen gegeben und 1 Minute lang verwirbelt, um die Zellen intermittierend aufzubrechen 1 Minute auf Eis abkühlen lassen. Das Vortexen wurde dreimal wiederholt und die resultierende Aufschlämmung wurde 15 Minuten lang bei 2822 × g und 4 ° C zentrifugiert, um das Pellet zu entfernen. Der erhaltene Überstand wurde mit vorgekühltem (–20 °C) 30 %igem Aceton versetzt und über Nacht bei 4 °C belassen, um das Enzym auszufällen. Später wurde die Acetonfraktion 15 Minuten lang bei 12.122 × g und 4 °C zentrifugiert, um den Niederschlag zu sammeln. Der Überstand wurde mit 40 % (v/v) Aceton versetzt und über Nacht bei 4 °C belassen. Der Fällungs-Zentrifugations-Zyklus wurde mit 50 und 60 % Aceton wiederholt und die Niederschläge wurden gepoolt und in Citratpuffer (200 mM) erneut aufgelöst und 4 Stunden lang bei 4 °C gelagert, um etwaiges restliches Aceton zu verdampfen. Die resultierende Lösung wurde auf PDC-Enzymaktivität51 und Proteinkonzentration64 untersucht und für den Biotransformationsprozess verwendet. Die PDC-Aktivität wurde als Bildung von PAC in 20 Minuten bei 25 °C aus 80 mM Benzaldehyd und 200 mM Pyruvat in Carboligase-Puffer gemessen43. Die Carboligase-Aktivität von einer Einheit wurde als die Enzymmenge definiert, die 1 µmol PAC aus Pyruvat und Benzaldehyd pro Minute bei pH 6,4 und 25 °C produzieren konnte, wie von Rosche et al.43 angegeben. Die Proteinkonzentration wurde gemäß dem Bradford-Assay mit Rinderserumalbumin als Proteinstandard65 bestimmt und die spezifische Carboligase-Aktivität wurde als Enzymeinheit pro Milligramm Protein (U mg−1) ausgedrückt. PAC, Benzaldehyd, Benzoesäure und Pyruvat wurden durch HPLC49,50 (Agilent Technologies) bei 283 nm unter Verwendung von 32 % (v/v) Acetonitril und 0,5 % (v/v) Essigsäure in destilliertem Wasser als mobile Phase und Altima bestimmt ™ C8-Säule mit Diodenarray-Detektor (DAD). Die Durchflussrate wurde auf 1,0 ml min−1 und die Temperatur des Detektors auf 28 °C eingestellt.

Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler ausgedrückt und die Analysen wurden mit Statistical Packages for the Social Sciences (SPSS, Version 17.0) unter Verwendung von Einweg-Varianzanalysen (ANOVA) durchgeführt. Statistische Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mithilfe von Duncans Mehrfachvergleichen ermittelt und bei p ≤ 0,0560,61 als signifikant angesehen.

Die in der vorliegenden Studie verwendeten Rohstoffe wie CC, SCB, SSB und RS waren die größten landwirtschaftlichen und agroindustriellen Abfälle in Thailand und wurden als wichtige lignozellulosehaltige Materialien eingestuft. Die anfängliche Vorbehandlung war erforderlich, um den Zucker aus den Rohstoffen freizusetzen, der von Hefen als Kohlenstoffquelle genutzt werden soll66.

Es wurde festgestellt, dass die Rohstoffe bei der Vorbehandlung unterschiedliche Zuckerkonzentrationen freisetzten, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die Vorbehandlung mit 1,84 % (Gew./Vol.) Calciumhydroxid und die anschließende enzymatische Verdauung ergaben im Vergleich zur Wasserbehandlung mit deutlich (p ≤ 0,05) höhere Zuckerkonzentrationen enzymatische Verdauung. Es wurde festgestellt, dass RS mit 68,9 ± 0,63 g L−1 die höchste Zuckerkonzentration freisetzt, gefolgt von SSB (51,8 ± 0,45 g L−1), SCB (48,4 ± 0,17 g L−1) und CC (38,9 ± 0,44 g L−1). ). Es wurde festgestellt, dass durch die Vorbehandlung mit Calciumhydroxid und anschließende enzymatische Behandlung 23 % (Gew./Gew.) Zucker aus RS freigesetzt wurden, was im Vergleich zu anderen Substraten, die einer ähnlichen Behandlung unterzogen wurden, um 44–64 % höher war. Bei der Vorbehandlung mit Calciumhydroxid und der anschließenden enzymatischen Behandlung von CC wurde im Vergleich zu jedem anderen Substrat die geringste Menge an Zucker in das Hydrolysat freigesetzt. Im Gegensatz zu den vorliegenden Ergebnissen verglichen Sumphanwanich et al.67 CC, SCB und RS hinsichtlich der Freisetzung von Zuckern bei Behandlung mit verdünnter Säure und stellten fest, dass CC höhere Zuckererträge lieferte als andere verglichene lignozellulosehaltige Materialien. Der im Vergleich zu anderen Materialien hohe Hemicellulose- und Ligningehalt von CC könnte die Wirkung von Cellulase während der enzymatischen Behandlung behindert und somit die Effizienz der Hydrolyse zur Freisetzung fermentierbarer Zucker verringert haben. Daher wurde CC von weiteren Experimenten ausgeschlossen.

Darüber hinaus wurde C. Tropicalis, eine Hefe, die in der Lage ist, Ethanol und PAC zu produzieren, verwendet, um geeignete Substrate zwischen SCB, RS und SSB zu screenen. Es wurde eine submerse Kultivierung durchgeführt und die Proben wurden in Abständen von 0, 24 und 48 Stunden analysiert. In der vorliegenden Studie führte der Anbau von C. Tropicalis in RS zu einer signifikanten (p ≤ 0,05) Steigerung der Ausbeute an getrockneter Biomasse um 22 % bzw. 19 % am Ende von 48 Stunden im Vergleich zu SCB bzw. SSB, die als Substrate verwendet wurden (Abb. 1 und Ergänzungstabelle S1). Darüber hinaus wurde bei allen Substraten am Ende von 48 Stunden im Vergleich zu ihren ursprünglichen Gegenstücken ein signifikanter (p ≤ 0,05) Abfall des pH-Werts beobachtet. In ähnlicher Weise wurde am Ende von 48 Stunden auch eine signifikante (p ≤ 0,05) Verringerung der gesamten löslichen Feststoffe um 40 %, 49 % und 52 % für SCB, RS und SSB im Vergleich zu ihren ursprünglichen Gegenstücken beobachtet (Supplementary). Tabelle S1). Diese Verringerung der löslichen Feststoffe hängt mit der Nutzung von Kohlenstoffquellen zur Energiesynthese zusammen, während Stickstoff bei der Synthese von Enzymen, Proteinen, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) verwendet wurde68.

Kinetische Profile von Gesamtzucker, einzelnen Zuckern (Cellobiose, Glucose, Xylose und Arabinose), Ethanol, Essigsäure und Konzentrationen getrockneter Biomasse während der Kultivierung von C. Tropicalis TISTR 5306 auf verschiedenen Substraten, Zuckerrohrbagasse (SCB); Reisstroh (RS); süße Sorghum-Bagasse (SSB). Der Standardfehler lag in allen Fällen entweder innerhalb der Empfindlichkeitsgrenze der Nachweisverfahren oder unter 10 %.

Wie in Abb. 1 gezeigt, betrug die anfängliche Gesamtzuckerkonzentration 47,9 ± 0,3, 63,1 ± 3,1 und 47,0 ± 1,0 g L−1 und während der Kultivierung betrug der Zuckerverbrauch 92 %, 79 % und 84 %, nach 24 Stunden 94 %. , 79 % bzw. 95 % am Ende von 48 Stunden für SCB, RS und SSB. Die maximale Ethanolproduktion erfolgte bei SCB und RS nach 24 Stunden, während sie bei SSB nach 48 Stunden mit 17,7 ± 0,2, 18,6 ± 0,2 bzw. 14,7 ± 0,5 g L−1 lag. Andere kinetische Parameter wie Qp, µ, qs,tot, Yeth/s, Yace/s und Yx/s wurden in der Ergänzungstabelle S2 dargestellt. Der Qp betrug 0,74, 0,78 bzw. 0,31 g L−1 h−1 für SCB, RS und SSB. Aus den Ergebnissen lässt sich erkennen, dass die Yeth/s während der Kultivierung von C. Tropicalis in unterschiedlichen Substraten zwischen 0,33 und 0,40 g Ethanol betrugen, wobei in den ersten 0–24 Stunden der Kultivierung g-1 Zucker verbraucht wurden, und zwischen 0,33 und 0,37 während 0 –48 Std. Die höchsten Yeth/s wurden mit SCB und RS ohne signifikanten Unterschied (p > 0,05) in der Ausbeute erzielt.

Aus der Score-Ranking-Analyse (Tabelle 2) ging hervor, dass RS hinsichtlich der Ethanol- und Biomasseproduktion überlegen ist und für weitere Studien ausgewählt wurde. Im Gegensatz zu den Ergebnissen gaben Sumphanwanich et al.67 an, dass die Ethanolproduktion von S. cerevisiae auf RS-Hydrolysat im Vergleich zu Bagasse und CC geringer war. Ihre Ergebnisse entsprachen jedoch dem anfänglichen Zuckergehalt der Substrate. In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass RS im Vergleich zu anderen Substraten den höchsten anfänglichen Zuckergehalt aufweist, was zu einem höheren Ethanolgehalt führt.

Die Hefen C. Tropicalis, C. Shehatae, S. Cerevisiae und K. Marxianus wurden in dieser Studie bewertet, da die Möglichkeit besteht, dass die PDC-Enzyme verschiedener Ethanol produzierender Hefen unterschiedliche Enzymaktivitäten aufweisen. S. cerevisiae ist der beliebteste und überlegenste Hefestamm zur Herstellung von Ethanol, da er im Vergleich zu vielen anderen Hefen hohen Ethanolkonzentrationen standhalten kann69. Dennoch wurden die Hefen C. Tropicalis, C. Shehatae und K. Marxianus in die Studie einbezogen, da sie neben Hexosezuckern (Saccharose und Glucose) auch Pentosezucker (Xylose und Arabinose) verwerten können, die S. cerevisiae nicht verwerten kann. . Darüber hinaus ist die Hefe C. Tropicalis resistent gegen aus Lignin gewonnene Abbaustoffe, die eine hemmende Wirkung auf das Hefewachstum haben70,71,72,73. Daher wurden die oben genannten vier Hefen auf ihr Potenzial durch Fermentation von RS-Substrat hin untersucht. Die während der Kultivierung aufgetretenen Parameteränderungen sind in Abb. 2 und der Ergänzungstabelle S3 dargestellt. Die Daten für pH und TSS werden in der Ergänzungstabelle S3 dargestellt. Es wurde eine signifikante (p ≤ 0,05) Abnahme des pH-Werts während der Kultivierung zwischen 0 und 24 Stunden und eine weitere leichte Abnahme zwischen 24 und 48 Stunden beobachtet. Der anfängliche Gehalt an löslichen Feststoffen lag bei den untersuchten Hefen zwischen 12,5 ± 0,3 und 12,7 ± 0,07 °Brix. C. Tropicalis zeigte im Vergleich zu anderen Hefen nach 48-stündiger Kultivierung eine maximale Feststoffausnutzung, was aus der Analyse des Gesamtzuckerverbrauchs nach 48 Stunden ersichtlich ist. Es wurde kein signifikanter (p > 0,05) Unterschied in der Konzentration der getrockneten Biomasse zwischen C. Tropicalis, C. Shehatae und S. Cerevisiae beobachtet, während bei K. Marxianus im Vergleich zu anderen Hefen nach 48-stündiger Kultivierung eine geringere Biomasseproduktion beobachtet wurde. Während andere Hefen Yx/s im Bereich von 0,05 ± 0,01 bis 0,08 ± 0,01 gg−1 produzierten, produzierte K. marxianus nur 0,03 ± 0,01 g Biomasse und verbrauchte g−1 Zucker.

Kinetische Profile von Gesamtzucker, einzelnen Zuckern (Cellobiose, Glucose und Xylose), Ethanol, Essigsäure und getrockneter Biomassekonzentration während der Kultivierung verschiedener Hefen, nämlich C.tropicis TISTR 5306, C. shehatae TISTR 5843, S. cerevisiae TISTR 5606 und K .marxianus var. marxianus TISTR 5057 mit Reisstroh als Substrat. Die Standardfehler lagen in allen Fällen entweder innerhalb der Empfindlichkeitsgrenze der Nachweisverfahren oder unter 10 %.

Die anfängliche Gesamtzuckerkonzentration vor der Kultivierung betrug 61,6 ± 0,6, 62,4 ± 1,4, 62,2 ± 0,3 bzw. 61,6 ± 0,7 g L−1 für C.tropicis, C. shehatae, S. cerevisiae und K. marxianus. Es wurde beobachtet, dass C. Tropicalis und S. cerevisiae 66,0 % bzw. 65,0 % des Gesamtzuckers verbrauchten, um nach 24-stündiger Kultivierung maximales Ethanol mit Konzentrationen von 15,2 ± 0,3 bzw. 14,5 ± 0,08 g L−1 Ethanol zu produzieren. Allerdings erzeugten C. shehatae und K. marxianus die maximale Ethanolkonzentration erst nach 48-stündiger Kultivierung mit einem Verbrauch von 50,6 % bzw. 63,2 % Gesamtzucker auf 11,1 ± 0,27 bzw. 11,8 ± 0,17 g L−1 Ethanol.

Der Vergleich der Kinetik ist in der Ergänzungstabelle S4 dargestellt. Der Qp betrug 0,64, 0,23, 0,61 bzw. 0,25 g L−1 h−1 für C.tropicis, C. shehatae, S. cerevisiae und K. marxianus. Es wurde festgestellt, dass die mit C. Tropicalis erhaltenen Yeth/s um 8,6, 5,5 bzw. 31,0 % höher waren als die von C. shehatae, S. cerevisiae und K. marxianus. nach 24 h Kultivierung. Die FE aus diesem Experiment wurde für C.tropicis, S. cerevisiae, C. shehatae und K. marxianus auf der Grundlage einer theoretischen Ausbeute von 0,511 g Ethanol g auf 74,5 %, 70,6 %, 68,6 % bzw. 58,8 % berechnet −1 Glukose74. Die höhere Ethanolausbeute bei C. Tropicalis im Vergleich zu anderen Hefen wird auf die Verträglichkeit der ehemaligen Hefe gegenüber Temperatur, Ethanol und ligninähnlichen toxischen Polyphenolen zurückgeführt, außerdem auf die Fähigkeit, in Hemizellulose von agroindustriellen Produkten enthaltene Pentosezucker zu nutzen70.

Bei C. Tropicalis und S. cerevisiae sank die Ethanolkonzentration 48 Stunden nach der Kultivierung weiter, da der Glucosegehalt im Medium abnahm. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass, wenn Glukose knapp wird, das beim Anbau erzeugte Ethanol als Kohlenstoffquelle verwendet wird, was eine Verlagerung auf die Atmung als Anpassung erfordert, was zu einer massiven Neuprogrammierung der Genexpression führt75. Dies könnte zur Bildung von Essigsäure nach 24-stündiger Kultivierung geführt haben. Die Essigsäureausbeute (Yace/s) war bei S. cerevisiae am Ende der Kultivierung zwar höher, unterschied sich jedoch bei den Hefen mit Ausnahme von C. shehatae nicht signifikant (Ergänzungstabelle S4). Wenn C. Tropicalis und S. Cerevisiae in einem Medium mit Glucosemangel gezüchtet wurden, könnten sie durch die Wirkung der Aldehyddehydrogenase aus Ethanol erzeugtes Acetaldehyd in Essigsäure umgewandelt haben76. Künftig ist die Reduzierung der Nebenproduktbildung, insbesondere der Essigsäure, ein besonderes Anliegen bei der Entwicklung eines wettbewerbsfähigen Bioprozesses und entscheidet über die Gesamteffizienz des Prozesses77.

Während der 0–24-stündigen Kultivierung wurde bei C. Tropicalis nur eine vernachlässigbare Verringerung der Xylose beobachtet, was darauf hindeutet, dass Pentose-fermentierende Hefen, insbesondere Candida sp. verwenden vorzugsweise Glukose in Mischungen aus Pentose- und Hexose-Zuckern, da der Abbau von Pentose-Zuckern stark unterdrückt wird78. Sobald Glukose verbraucht wurde, werden Enzyme für den Abbau von Pentosezuckern synthetisiert, wie in der vorliegenden Studie deutlich wird, in der 24–48 Stunden lang 30 % (Gew./Vol.) Xylose verwendet wurden (Abb. 2). Die übrigen Hefen konsumierten jedoch keine Xylose, da sie für ihr Wachstum andere Hexosezucker oder Pentosezucker gegenüber Xylose bevorzugen79. Ebenso konnte keine der in der Studie verwendeten Hefen Cellobiose effizient nutzen, da ihnen sowohl ein Cellobiose-Transporter als auch eine β-Glucosidase fehlt, die Cellobiose in Glucose hydrolysieren kann80. Allerdings zeigten Zheng et al.81, dass C. molishiana neben Glucose auch Cellobiose nutzen und Ethanol produzieren konnte. Die Akkumulation von Cellobiose in der vorliegenden Studie könnte auf die hemmende Wirkung von Glucose durch eine starke Hemmung der Produktrückkopplung zurückzuführen sein. Beispielsweise sind sowohl Endoglucanase- als auch ß-Glucosidase-Aktivitäten erforderlich, um Cellulose in Cellobiose bzw. Cellobiose in Glucose aufzuspalten. Allerdings kann die Anreicherung von Glukose die ß-Glucosidase hemmen, und Cellobiose kann die Endoglucanase-Aktivität hemmen82. Somit kann die Verwendung eines synergistischen Verhältnisses von Endoglucanase und β-Glucosidase eine hohe Menge an Glucose und damit Ethanol liefern. Dadurch wird auch der Glukosemangel im Medium überwunden und das Verhältnis von Ethanol zu Essigsäure verbessert.

Die durch Zentrifugation aus der Kultivierungsbrühe gewonnenen Hefen wurden lysiert und auf PDC-Aktivität analysiert. Abbildung 3 und Ergänzungstabelle S5 zeigen das Enzym und die spezifische Aktivität von PDC in der Biomasse von C. Tropicalis, C. Shehatae, S. Cerevisiae und K. Marxianus. Es wurde festgestellt, dass die Enzymkonzentration in der Anfangsphase der Kultivierung (bis zu 24 Stunden) höher war, wobei nach 48 Stunden Kultivierung ein weiterer Rückgang zu beobachten war. Unter den Hefen wurde eine höhere Konzentration bei C. Tropicalis mit 0,303 ± 0,020 U mL−1 und einer spezifischen Aktivität von 0,469 ± 0,053 U mg−1 Protein nach 24-stündiger Kultivierung beobachtet. Im Gegensatz dazu besaß C. shehatae mit 0,053 ± 0,004 U mL−1 die geringste volumetrische Enzymaktivität, was im Vergleich zu C. Tropicalis nach 24-stündiger Kultivierung um das Sechsfache geringer war.

Intrazelluläre Pyruvatdecarboxylase (PDC)-Aktivität von Hefen während der Kultivierung mit Reisstroh als Substrat (a) Volumetrische PDC-Enzymaktivität von Zelllysat; (b) Spezifische PDC-Enzymaktivität des Zelllysats. Fehlerbalken geben den Standardfehler vom Mittelwert an (n = 3). Mittelwerte mit unterschiedlichen Großbuchstaben zeigten einen signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen Zeitintervallen derselben Hefeart. Mittelwerte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben zeigten einen signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen den jeweiligen Zeitpunkten zwischen den Hefearten.

Die in Tabelle 3 dargestellte Score-Ranking-Analyse ergab, dass C. Tropicalis bei Ethanol, Biomasseproduktion und PDC-Enzymaktivität mit einem Gesamtscore von 368 ± 7 von 400 überlegen ist, gefolgt von C. shehatae, K. marxianus und S . cerevisiae. Daher wurde C. Tropicalis weiteren Biotransformationsstudien unterzogen, um PAC aus den Vorläufern Pyruvat und Benzaldehyd zu synthetisieren.

Biotransformationsstudien wurden in einem zweischichtigen Flüssigkeitssystem entweder mit Biomasse ganzer Zellen der Hefe C. Tropicalis oder ihrem teilweise gereinigten Enzym durchgeführt. Der Grund für die Biotransformation in einem Doppelschichtsystem liegt darin, dass der Vorläufer Benzaldehyd, der nur in der organischen Phase löslich ist, seine Wechselwirkung mit PDC in der wässrigen Phase verhindert und dadurch die Stabilität des Enzyms bewahrt83. Es gibt mehrere Lösungsmittel, darunter Octanol, Heptanol, Hexanol, Butanol und viele, die als organisches Phasensystem für den Biotransformationsprozess verwendet werden können50. Aufgrund der höheren Kosten wurde in der vorliegenden Studie jedoch ein Pflanzenöl als organische Phase verwendet, um die Produktionskosten zu senken. Obwohl der in der wässrigen Phase verwendete MOPS-Puffer dazu beitragen könnte, die Stabilität des PDC-Enzyms aufrechtzuerhalten, behindern seine relativ hohen Kosten seine Anwendung im industriellen Maßstab. Daher könnte der in der vorliegenden Studie verwendete Phosphatpuffer ein geeigneter, kostengünstiger Ersatz für den MOPS-Puffer sein61.

Aus den Ergebnissen wurde beobachtet, dass die Biomasse von C. Tropicalis (12,24 g L−1), entsprechend 1,29 ± 0,12 U mL−1, PAC mit einer Gesamtkonzentration von 32,6 ± 1,6 mM nach 60 Minuten und der Konzentration produzieren konnte nahm mit der Reaktionszeit zu und erreichte nach 6 Stunden das Doppelte (Abb. 4a und Ergänzungstabelle S6). Mit anderen Worten: Die gesamten Zellen von C. Tropicalis PDC bei 1,29 U/ml erzeugten eine volumetrische Produktion von 1,56 g PAC L−1 h−1 bei 10 °C mit einer spezifischen Produktivität von 3,05 gg−1 Biomasse h−1. Die organische Phase war im Vergleich zur wässrigen Phase für eine deutlich höhere PAC-Bildung verantwortlich (p ≤ 0,05), was die Ergebnisse von Rosche et al.41 bestätigt, die eine PAC-Konzentration von 687 mM in der organischen Octanolphase berichteten, während die wässrige Phase nur 86,7 mM aufwies . In ähnlicher Weise fanden Agustina et al.50 heraus, dass in der organischen Schicht die PAC-Konzentration bis zu 19,6 mM betrug, während die Pufferschicht nur 1,76 mM aufwies.

Biotransformation von Phenylacetylcarbinol (PAC) in einem Zweischichtsystem. (a) PAC-Konzentration, wenn die Biomasse ganzer Zellen von C. Tropicalis als Biokatalysator verwendet wurde; (b) PAC-Konzentration, wenn teilweise gereinigtes PDC als Biokatalysator verwendet wurde. Fehlerbalken geben den Standardfehler vom Mittelwert an (n = 3). Mittelwerte mit unterschiedlichen Großbuchstaben zeigten einen signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen der wässrigen Phase, der Ölphase und insgesamt bei gleicher Reaktionszeit. Mittelwerte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben zeigten einen signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen den Zeitintervallen der jeweiligen Schicht.

Zusätzlich zur gesamten Biomasse von C. Tropicalis wurde auch das aus seiner Biomasse gewonnene PDC-Enzym für den Biotransformationsprozess genutzt. Die Ergebnisse zeigten, dass die insgesamt höchste PAC-Konzentration nach 60 Minuten bei 19,7 ± 2,2 mM lag und mit zunehmender Reaktionszeit auf 6 Stunden weiter abnahm (Abb. 4b und Ergänzungstabelle S7). Es wurde beobachtet, dass kein signifikanter (p > 0,05) Unterschied in der PAC-Konzentration zwischen der wässrigen Schicht und der organischen Schicht des Biotransformationssystems besteht. Im Gegensatz zur vorliegenden Studie fanden Sandford et al.84 heraus, dass die PAC-Produktion in einem Zweiflüssigkeitssystem mit teilweise gereinigten PDC-Enzymen aus C. utilis bis zu 937 mM PAC in der organischen Schicht und 127 mM in der wässrigen Schicht produzierte. Es wurde auch festgestellt, dass in der vorliegenden Studie die Biotransformation, an der teilweise gereinigte Enzyme beteiligt waren, im Vergleich zur gesamten Zellbiomasse von C. Tropicalis weniger PAC ergab. Die höhere PAC-Produktion, die mit Ganzzell-PDC im Vergleich zu teilweise gereinigtem PDC erreicht wird, könnte mit einer höheren Enzymstabilität in der Ganzzellpräparation zusammenhängen85. Dies ist auf die Phospholipide als Zellbestandteil zurückzuführen, die als Barriere der Zellhülle fungieren und den Enzymen in den Zellen physikalischen Schutz bieten86. Darüber hinaus kann die zellfreie Enzymzubereitung zu einer PDC-Deaktivierung durch das Substrat Benzaldehyd führen87. Dies geht aus einer von Satianegara et al.85 durchgeführten Studie hervor, die über einen Verlust der Halbwertszeit von teilweise gereinigtem PDC um 86 % berichtete, verglichen mit nur 62 % bei der Zubereitung ganzer Zellen bei 4 °C in Gegenwart von 50 mM Benzaldehyd.

In der vorliegenden Studie wurde entweder die Biomasse ganzer Zellen (12,24 g L-1) mit einer anfänglichen volumetrischen PDC-Aktivität von 1,29 ± 0,12 U mL-1 oder teilweise gereinigtes Enzym, das aus 12,24 g Biomasse mit einer Aktivität von 0,32 ± 0,04 U mL-1 isoliert wurde, verwendet Biokatalysatoren. Obwohl die anfängliche PDC-Aktivität zwischen den Katalysatoren ungleich war, kann davon ausgegangen werden, dass der Enzymreinigungsprozess höhere Kosten und relativ hohe Gesamtverluste an Enzymaktivität verursachen könnte, um die gleiche Menge an Enzym zu erhalten. Ziel der Studie ist es daher, die Katalysatoren für eine höhere PAC-Produktion zu bewerten, ohne dass zusätzliche Kosten entstehen. Darüber hinaus bietet die Verwendung ganzer Zellen Vorteile gegenüber teilweise gereinigtem PDC, da ersteres möglicherweise eine höhere Katalysatorstabilität bietet als das enzymatische Gegenstück, da teilweise gereinigtes PDC anfälliger für den Deaktivierungseffekt durch Benzaldehyd ist44. Sowohl bei der Biomasse ganzer Zellen als auch beim teilweise gereinigten Enzym-Biokatalysatorsystem kam es bei Verwendung von Pflanzenöl als organisches Phasensystem nicht zur Bildung von Acetoin und Benzylalkohol als Nebenprodukte. Dies folgt Satianegara et al.88, die die vorgefrorene Biomasse ganzer Zellen und das teilweise gereinigte Enzym von C. utilis untersuchten und keine Bildung von Benzylalkohol berichteten. Allerdings wurde in anderen Studien, die immobilisierte ganze Zellen verwendeten89, die Produktion von Benzylalkohol beobachtet. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass das innerhalb der ersten Stunde gebildete PAC die Bildung von Benzylalkohol hemmt, da es die Aktivität der Alkoholdehydrogenase90 hemmen kann, oder dass es aufgrund des Vorgefrierprozesses zu einer Abnahme der Alkoholdehydrogenaseaktivität kommen könnte88. Aus dem Vergleich ganzer Zellen und teilweise gereinigter PDC bei der PAC-Biotransformation wird deutlich, dass die Nutzung ganzer Zellen als Biokatalysatoren ein erhebliches Kostensenkungspotenzial im Hinblick auf deutlich höhere PAC-Konzentrationen bietet.

Die Forschung untersuchte die Nutzung agrarbasierter Rohstoffe SCB, SSB, CC und RS für die Herstellung von Ethanol und die Biotransformation von PAC. Hierzu wurden verschiedene ethanolproduzierende Hefen, C. Tropicalis, C. Shehatae, S. Cerevisiae und K. Marxianus, auf ihr Potenzial untersucht. Die Studie verglich auch den Biotransformationsprozess, an dem die Biomasse ganzer Zellen beteiligt ist, mit dem Prozess, an dem das teilweise gereinigte Enzym für die PAC-Produktion beteiligt ist. Kurz gesagt, mit C. Tropicalis fermentiertes RS-Substrat ergab einen höheren Ethanolgehalt (12,7 ± 0,23 g L−1) und eine höhere spezifische PDC-Aktivität (0,351 ± 0,076 U mg−1 Protein). Darüber hinaus könnte eine höhere PAC-Bildung (62,3 ± 4,4 mM) möglich sein, wenn der Biotransformationsprozess in einem zweischichtigen System mit der gesamten Zellbiomasse von C. Tropicalis als Biokatalysator durchgeführt würde. Daher ergab diese Studie, dass sich die Biokonvertierung agroindustrieller Produkte als effizient im Hinblick auf die Linderung von Abfallentsorgungsproblemen bei gleichzeitiger Produktion von Ethanol und Phenylacetylcarbinol erweisen würde. Der verbrauchte Rückstand der Agrarmaterialien nach der enzymatischen Behandlung muss noch hinsichtlich seiner Zusammensetzungsanalyse bewertet werden und könnte als Tierfutterzusatz verwendet werden, um bei dem Prozess keine Abfälle zu erzeugen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Feinstaub

Phenylacetylcarbinol

Pyruvat-Decarboxylase

Hefeextrakt-Pepton-Dextrose

Ausbeute an erzeugtem Ethanol im Verhältnis zum Gesamtzuckerverbrauch

Ausbeute an produzierter Essigsäure im Verhältnis zum Gesamtzuckerverbrauch

Ausbeute an getrockneter Biomasse im Verhältnis zum Gesamtzuckerverbrauch

Volumetrische Produktivität von Ethanol pro Liter pro Stunde; µ, spezifische Wachstumsrate (h−1)

Spezifische Gesamtzuckerverbrauchsrate (g Gesamtzuckerverbrauch, g−1 Biomasse h−1)

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

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Die Autoren danken den Förderern dieses Forschungsprojekts durch den Fundamental Fund 2022, Universität Chiang Mai (Fördernummer: FRB650031/0162), TRF Senior Research Scholar (Fördernummer: RTA6280001), Universität Chiang Mai (CMU), Fakultät für Naturwissenschaften (CoE65-P001) – CMU, Cluster of Agro Bio-Circular-Green Industry (Agro-BCG) (CoE65-P001), Office of Research Administration (ORA), Fakultät für Agrarindustrie, Bioprocess Research Cluster (BRC), CMU und Sino-Thai-NRCT (NRCT(O)(KKT)-19/2561). N. Leksawasdi möchte der Fakultät für Agrarindustrie der CMU seinen aufrichtigen Dank für die Finanzierung/Sachleistungen aussprechen. K. Anbarasu ist dankbar für die Unterstützung durch das Postdoctoral Fellowship (Reinventing University) der Chiang Mai University. TISTR wird auch für die Unterstützung mikrobieller Stämme gedankt.

(1) Fundamental Fund (Grant-Nummer: FRB650031/0162), (2) TRF Senior Research Scholar (Grant-Nummer: RTA6280001), (3) Chiang Mai University, Faculty of Science (CoE65-P001) – CMU, (4) Cluster of Agro Bio-Circular-Green Industry (Agro-BCG) (CoE65-P001), (5) Sino-Thai-NRCT (NRCT(O)(KKT)-19/2561) und (6) Chiang Mai University – Postdoktorand Fellowship (Universität neu erfinden).

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Rojarej Nunta, Charin Techapun, Sumeth Sommanee, Chatchadaporn Mahakuntha, Kritsadaporn Porninta, Yuthana Phimolsiripol, Pornchai Rachtanapun, Kittisak Jantanasakulwong, Anbarasu Kumar und Noppol Leksawasdi

Abteilung für Lebensmittelinnovation und -wirtschaft, Fakultät für Agrartechnologie, Lampang Rajabhat University, Lampang, 52100, Thailand

Rojarej-Hochzeit

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Charin Techapun, Sumeth Sommanee, Chatchadaporn Mahakuntha, Kritsadaporn Porninta, Yuthana Phimolsiripol, Pornchai Rachtanapun, Kittisak Jantanasakulwong, Anbarasu Kumar und Noppol Leksawasdi

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Winita Punyodom, Yuthana Phimolsiripol, Pornchai Rachtanapun, Kittisak Jantanasakulwong und Noppol Leksawasdi

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Wen Wang, Xinshu Zhuang und Wei Qi

Forschungsgruppe zur Entwicklung mikrobieller Wasserstoffproduktionsprozesse, Khon Kaen University, Khon Kaen, 40002, Thailand

Alissara Reungsang

Abteilung für Biotechnologie, Fakultät für Technologie, Khon Kaen University, Khon Kaen, 40002, Thailand

Alissara Reungsang

Akademie der Wissenschaften, Royal Society of Thailand, Bangkok, 10300, Thailand

Alissara Reungsang

Abteilung für Biotechnologie, Periyar Maniammai Institute of Science & Technology, Thanjavur, 613403, Indien

Anbarasu Kumar

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Konzeptualisierung, RN und NL; Methodik, RN; Validierung, NL und CT; Datenkuration, RN, SS., CM, KP und AK; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, RN; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, RN, AK, NL, CT, SS, CM, KP, YP, PR, KJ, WP, WW, XZ, WQ und AR; Projektverwaltung, NL; Finanzierungseinwerbung, NL Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Korrespondenz mit Anbarasu Kumar oder Noppol Lexawasdi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nunta, R., Techapun, C., Sommanee, S. et al. Verwertung von Reisstroh, Zuckerrohr-Bagasse und süßer Sorghum-Bagasse zur Herstellung von Bioethanol und Phenylacetylcarbinol. Sci Rep 13, 727 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27451-4

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Eingegangen: 12. Oktober 2022

Angenommen: 02. Januar 2023

Veröffentlicht: 13. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27451-4

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Biomasseumwandlung und Bioraffinerie (2023)

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