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Sep 16, 2023

Heterologe Mogroside-Biosynthese in Gurken und Tomaten durch genetische Manipulation

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 191 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mogroside werden häufig als hochwertige natürliche Süßstoffe ohne Kalorien verwendet, die eine Reihe biologischer Aktivitäten aufweisen und die Züchtung pflanzlicher Aromen durch moderne molekulare Biotechnologie ermöglichen. In dieser Studie haben wir eine auf In-Fusion basierende Gen-Stacking-Strategie für das Transgen-Stacking und einen Multi-Gen-Vektor entwickelt, der 6 Mogroside-Biosynthesegene beherbergt, und ihn in Cucumis sativus und Lycopersicon esculentum umgewandelt. Hier zeigen wir, dass transgene Gurken Mogrosid V und Siamenosid I mit 587 ng/g FG bzw. 113 ng/g FG produzieren können, und kultivierte transgene Tomaten mit Mogrosid III. Diese Studie liefert eine Strategie zur Verbesserung des Gemüsegeschmacks und ebnet den Weg für die heterologe Biosynthese von Mogrosiden.

Die Vorliebe für den Geschmack von Nahrungsmitteln zieht sich durch die gesamte Evolutionsgeschichte des Menschen, und diese Vorliebe war gelegentlich höher als der menschliche Ernährungsbedarf. Aromen haben eine entscheidende Rolle bei der Lebensmittelpräferenz gespielt, und der Geschmack vermittelte ein Gefühl des Genusses, was wichtige Auswirkungen auf die Verbesserung des Appetits, der Verdauung und die Steigerung der Nährstoffverwertung hat1. Darüber hinaus hat der Mensch bereits damit begonnen, den Geschmack von Gemüse und Früchten zu verbessern, was letztendlich zu einer Steuerung der Ernährungskosten und einer Verbesserung der menschlichen Gesundheit geführt hat2. Im letzten halben Jahrhundert hat das Züchtungsziel einer hohen Pflanzenproduktivität indirekt zu einer Verringerung des Geschmacks und der Nährstoffe geführt3. Aufgrund der genetischen Verknüpfung scheinen Qualitätsmerkmale einen negativen Zusammenhang mit dem Ertrag zu haben, und wünschenswerter Geschmack, hoher Ertrag und hohe Qualität sind komplexe Merkmale, die von mehreren Genen gesteuert werden4. Generell bleibt die Pflanzenzüchtung zur Geschmacksverstärkung aufgrund des hohen Ertrags und der guten Qualität weiterhin eine große Herausforderung. Seit 1983 ermöglichen große Fortschritte in der transgenen Biotechnologie eine einfachere und praktikablere Züchtung zur Verbesserung des Geschmacks und der Nährwertqualität5. Wie bereits gezeigt wurde, gibt es in modernen kommerziellen Tomatensorten offensichtlich keine geschmacksassoziierten flüchtigen Stoffe. Infolgedessen haben Wissenschaftler Tomatenpflanzen durch die Expression der Geraniolsynthase aus Ocimum basilicum so verändert, dass die Früchte einen Zitronengeschmack und ein rosenartiges Aroma aufweisen6. Darüber hinaus ist allgemein bekannt, dass TomLoxC den Geschmack von Tomatenfrüchten beeinflusst, indem es die flüchtige Biosynthese von C5 und C6 aus Lipiden katalysiert7. Darüber hinaus haben frühere Untersuchungen darauf hingewiesen, dass die Transformation des VpVAN-Gens, das die Vanillin-Biosynthese reguliert, den einzigartigen Geschmack von Pfeffer verändert hat8. Offensichtlich ist die Pflanzenzüchtung mit homologen oder heterologen Transgenen im Zusammenhang mit Geschmack zu einem beliebten Forschungsthema geworden, das wahrscheinlich auch in Zukunft anhalten wird.

Die Vorliebe für Süßes ist eine Art menschlicher Instinkt, und Süße wurde als grundlegendes hedonisches Vergnügen beschrieben9. Süße Lebensmittel mit Zucker als Hauptbestandteil haben weltweit in allen Altersgruppen zu einem deutlichen Anstieg von Fettleibigkeit, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen geführt10; Daher ist es notwendig, zuckerfreie Süßstoffe für den Einsatz in der täglichen Ernährung zu erforschen. Ebenso wandelten Wissenschaftler süß schmeckende Proteine ​​in Gurken11, Tomaten12,13, Erdbeeren14, Birnen15 und Salat13,16 für die Züchtung süß schmeckender Nutzpflanzen um. Allerdings waren süße Proteine ​​häufig aufgrund des hohen Preises, der unzureichenden Versorgung, des schlechten Geschmacks sowie der kurzen Haltbarkeit und Stabilität begrenzt17. 1983 wurde Mogrosid V, ein zuckerfreier Süßstoff, der aus der einzigartigen Frucht Siraitia grosvenorii (Cucurbitaceae; Luo-han-guo oder Mönchsfrucht) isoliert wurde, in China entdeckt18,19,20 und 2010 von der FDA zugelassen. Mogroside werden in mehrere süße Komponenten unterteilt, wie Mogrosid III, Siamenosid I und Mogrosid V. Die Süße von Mogrosiden unterscheidet sich je nach Anzahl der Glykosylierung und Glykosylierungsstellen21. Der große Vorteil von Mogrosid V ist sein hervorragender Geschmack im Vergleich zu Steviosiden, Rubusosid und Glycyrrhizin, die normalerweise leicht bitter und süß schmecken22,23. Interessanterweise hat dieser natürliche Süßstoff mit Antiglykationswirkung24 eine hohe Süße, einen geringen Kaloriengehalt und ist ungiftig; seine Süße ist etwa 300-mal höher als die von Saccharose25,26; und seine medizinische Verwendungsgeschichte reicht über 300 Jahre zurück27. Mogroside wurden von allen Arten anerkannter Marken im In- und Ausland zugelassen und verwendet und wurden bis Ende September 2019 in mehr als 4.300 Produkten auf der ganzen Welt eingesetzt. In China gelten Mogroside als eine Art von sicherer, ungiftiger und natürlicher Süßstoff, der in der Lebensmittel-, Getränke- und Pharmaindustrie weit verbreitet ist und weltweit ein großes kommerzielles Potenzial hat27. Im Jahr 2011 untersuchte unsere Gruppe den Mogrosid-V-Biosyntheseweg und 40 Schlüsselgene, die für Enzyme kodieren, wurden erstmals geklont28, was Spendergene für die Pflanzenzüchtung zur Verbesserung des süßen Geschmacks lieferte. Der Literatur zufolge kommt der Vorläufer der Mogrosid-V-Biosynthese, 2,3-Oxidosqualen, häufig in Pflanzen vor (Ergänzende Abbildung S1). Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass verschiedene Mogrosid-V-Synthase-Gene in Kandidatenpflanzen transformiert werden, um Süßpflanzen zu entwickeln, und diese transgenen Pflanzen können auch als vielversprechende Materialien für die Mogrosid-V-Produktion verwendet werden.

In den letzten 30 Jahren wurden in einigen Ländern und Gebieten viele transgene Pflanzen eingesetzt, bei denen ein einzelnes Merkmal genetisch verbessert wurde, um den kommerziellen Anbau zu fördern30. Mit der Entwicklung des Metabolic Engineering und der synthetischen Biologie wurde die Multigentransformation zur Regulierung der Biosynthese und zur Verbesserung mehrerer biologischer Eigenschaften anstelle der Einzelgentransformation eingesetzt, was ein aufkommender Trend in der Genzüchtung ist31. Bisher gab es zahlreiche Durchbrüche bei gentechnisch veränderten Pflanzen zur Bioanreicherung von Mikronährstoffen, Phytonährstoffen und bioaktiven Komponenten, wie z. B. mit β-Carotin angereicherter Golden Rice32, Kartoffel33, Banane34 und Raps35, Anthocyane-36, L-DOPA-37 und Folsäure38 und Flavonol-39, mit Betalain bioangereicherte40 Tomatenfrüchte, die durch Multigentransformation unter Einbeziehung gezielter Metaboliten-Biosynthesewege entwickelt wurden. Um die De-novo-Synthese von Mogrosid V zu erreichen, besteht das Schlüsselproblem in der Integration von 6 Mogroside-Biosynthesegenen in Kandidatenpflanzen. Wir haben daher ein einfaches und effizientes Multigen-Expressionssystem entwickelt, das auf In-Fusion-Technologie und selbstspaltenden 2A-Peptiden basiert. Darüber hinaus wurden sechs Mogrosid-V-Synthase-Gene erfolgreich in Gurken und Tomaten eingeführt, und alle Gene wiesen in den transgenen Pflanzen hohe Transkriptmengen auf. Dementsprechend haben wir zunächst eine transgene Süßgurkenpflanze mit Mogrosid V und eine leicht süße Tomate mit Mogrosid III (MIII) entwickelt. Diese Studie beschreibt umfangreiche zukünftige Anwendungen im Bereich der Züchtung von Gemüse- und Fruchtaromen und liefert einen wertvollen und faszinierenden Entwurf für die aufwändige Entwicklung außergewöhnlicher Pflanzenkeimplasmen mit bestimmten charakteristischen und vielfältigen Geschmacksrichtungen.

Die Promotoren AtUBQ10 und AtPD7 wurden aus Arabidopsis thaliana isoliert und zusammen mit dem GUS-Reportergen in einen pBI121-Vektor ligiert (Abb. 1a). Um die Eignung der Promotoren zu beurteilen, wurde eine vorübergehende Expression in den Keimblättern von Cucumis sativus wie zuvor beschrieben durchgeführt41. Blätter von Nicotiana benthamiana und Keimblätter von Cucumis sativus wurden unter den gleichen Bedingungen mit Agrobacterium infiziert, das pBI121 beherbergte, in dem das GUS-Gen durch AtUBQ10-, AtPD7- und CaMV 35S-Promotoren gesteuert wurde. Um die Funktion dieser Promotoren zu charakterisieren, wurde eine histochemische Färbung wie zuvor beschrieben durchgeführt42. Wie erwartet gab es unter der Kontrolle der AtUBQ10- und AtPD7-Promotoren in Cucumis sativus und Nicotiana benthamiana ein hohes Maß an GUS-Aktivität (Abb. 1b, c), und das höchste Expressionsniveau wurde 5 Tage nach der Infiltration von Cucumis sativus festgestellt. Daher war die Fähigkeit der AtUBQ10- und AtPD7-Promotoren, die Gentranskription in Cucumis sativus und Nicotiana benthamiana voranzutreiben, mit der des CaMV 35S-Promotors vergleichbar, und es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen Promotoren (Abb. 1b und Abb. 1c). Diese Promotoren könnten daher als starke konstitutive Promotoren verwendet werden, um die Genexpression im Multigenvektor voranzutreiben.

ein rekombinantes Plasmid mit verschiedenen Promotoren. b Histochemischer GUS-Assay der vorübergehenden Expression in Gurken. c Der histochemische GUS-Assay der vorübergehenden Expression wurde nach 48-stündiger Infiltration in Tabak durchgeführt. Als Negativkontrollen dienten WT-Pflanzen. 35S pro: CaMV 35S-Promotor; AtUBQ10 pro: AtUBQ10-Promoter; AtPD7 pro: AtPD7-Promotor.

Es wurde weithin nachgewiesen, dass der Vorläufer der Mogroside-Biosynthese 2,3-Oxidosqualen ist, das über den Mevalonat-Weg synthetisiert und durch eine Reihe von Enzymen katalysiert wird, um Mogrosid V in Siraitia grosvenorii zu synthetisieren (ergänzende Abbildung S1). Daher beherbergt das binäre Plasmid pCAMBIA1300 die mit der Mogroside-Synthese in Zusammenhang stehenden enzymkodierenden Gene SgSQE1, SgCS, SgEPH2, SgP450, SgUGT269-1 und SgUGT289-3 zusammen mit dem Hyg-Resistenzgen (Hyg, Selektionsmarker), das von AtPD7, AtUBQ10 und CaMV 35S gesteuert wird Promotoren wurden mittels In-Fusion-Technologie und selbstspaltenden 2A-Peptiden konstruiert (ergänzende Abbildung S2a). Zunächst wurden alle Zielgene in pBI121 oder pCAMBIA1300 ligiert, um die erste Genexpressionskassette zu erzeugen. Zweitens wurde die Region, die den Promotor, das Zielgen und den Terminator beherbergt, kloniert und in pCAMBIA1300 ligiert, um eine Doppelgen-Expressionskassette zu erzeugen. Anschließend haben wir durch die Kombination der ersten Genexpressionskassette und der Doppelgenexpressionskassette eine Dreifachgenexpressionskassette konstruiert. Schließlich wurden die Triple-Gen-Expressionskassetten durch P2A-Peptide in den endgültigen Vektor ligiert. (Ergänzende Abbildung S2a). Das entsprechende U22p-SCE-Plasmid wurde mittels PCR identifiziert (Ergänzende Abbildung S2b). Dieser Multigen-Expressionsvektor war groß (die Länge vom linken Rand zum rechten Rand betrug ~21,5 kb) und wurde zur Synthese von Mogrosiden verwendet. Das U22p-SCE-Plasmid wurde in Agrobacterium tumefaciens GV3101 eingeführt und die Transformanten wurden weiter für die genetische Transformation verwendet.

Um die Verfügbarkeit der Multigenvektoren weiter zu bestätigen, wurde ein transienter Expressionstest in Cucumis sativus durchgeführt. Alle mit der Mogroside-Biosynthese zusammenhängenden Gene wurden durch Agroinfiltration in den Keimblättern von Cucumis sativus exprimiert. Gemäß den Methoden unserer Vorstudie haben wir 5 Tage nach der Infiltration Proben von den Keimblättern von Cucumis sativus und 48 Stunden nach der Infiltration von den Keimblättern von Tabakblättern für die HPLC-ESI-MS/MS-Analyse entnommen. Wie in den ergänzenden Abbildungen S3a und S3b angegeben, akkumulierten MII-E und MIII leicht in den Keimblättern von Cucumis sativus, die mit dem U22p-SCE-Multigen-Expressionsvektor transformiert wurden, MI-A1 wurde jedoch nicht nachgewiesen. Leider wurde im multiplen transienten Expressionstest kein SI oder MV beobachtet. Das Fehlen einer Akkumulation von SI und MV ließ mindestens zwei Möglichkeiten vermuten: (i) Der transiente Expressionstest dauerte im Allgemeinen nur kurze Zeit. In diesem Fall reichte die Akkumulation von MIII-Substrat für die Produktion von SI und MV in den Keimblättern von nicht aus (Cucumis sativus) und (ii) der Multigen-Expressionsvektor war zu groß, um die Genexpression zu unterdrücken, was zur Reduzierung von MII-E und MIII führte. Dennoch bestätigte der transiente Expressionstest, dass ein Multigen-Expressionsvektor verfügbar war. Daher ist die stabile Transformation von Multigen-Expressionsvektoren für ihre genetische Transformation in Cucumis sativus und Lycopersicon esculentum erforderlich, was eine neue Vorstellung von der Mogroside-akkumulierenden Gemüsezüchtung liefert.

Um die Ernährungseigenschaften der Gurke zu verbessern, wurde der Multigen-Expressionsvektor U22p-SCE in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 eingeführt und der Mogroside-Biosyntheseweg gentechnisch verändert, um Mogroside in Gurkenpflanzen zu produzieren. Etwa 500 Gurkenblattexplantate wurden einer Agrobacterium-vermittelten Transformation mit dem U22p-SCE-Vektor unterzogen. Unter diesen betrug die Gesamtzahl der Hyg-resistenten Linien etwa 15, aber viele Hyg-resistente Linien waren nicht in der Lage, Wurzeln zu schlagen, zu überleben und auf Sämlingen zu wachsen. Schließlich wurden nach Domestizierung und Transplantation nur 5 transgene Pflanzen im Gewächshaus gezüchtet. Alle transgenen Pflanzen und nicht transformierten Pflanzen wurden im Gewächshaus mit gleichbleibender Wachstumsumgebung kultiviert (Abb. 2a). Um die Integration der Transgene in das Genom der Gurkenpflanzen nachzuweisen (Abb. 2b), wurde genomische DNA extrahiert, um das Vorhandensein von Zielgenen und Hyg-Genen mithilfe genspezifischer Primer mittels PCR zu bestimmen (Ergänzungstabelle S4). Fragmente der erwarteten Größe wurden in allen Hyg-resistenten transgenen Linien nachgewiesen (Abb. 2c). Ein 1587-bp-Fragment von SgSQE1, ein 2280-bp-Fragment von SgCS, ein 951-bp-Fragment von SgEPH2, ein 1421-bp-Fragment von SgP450, ein 1253-bp-Fragment von SgUGT269-1, ein 1026-bp-Fragment von SgUGT289-3 und ein 392-bp-Fragment des Hyg-Resistenzgens gleichzeitig in der einen transgenen Pflanze (U1) nachgewiesen, jedoch nicht aus WT-Gurkenpflanzen amplifiziert (Abb. 2c). Bei anderen Pflanzen existierten mithilfe der PCR-Amplifikation fast nie alle sechs Gene. Die Daten des Gurkentransformationsexperiments sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Insgesamt erhielten wir nach der Transformation mit dem U22p-SCE-Vektor nur eine unabhängige transgene Gurkenlinie. Obwohl die Transformationshäufigkeit in dieser Studie relativ niedrig war, ist dies die erste Studie, in der 6 Gene gleichzeitig in das Gurkengenom transformiert wurden, und eine Transformation großer Vektoren ist unvorhersehbar. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Effizienz der genetischen Transformation von Gurken immer noch sehr unterschiedlich ist und dass die Genotypen der verwendbaren Explantate begrenzt sind. Um die Transformationseffizienz mit Multigen-Vektoren in einem Agrobacterium-vermittelten System zu verbessern, muss der wesentliche Schritt der genetischen Transformation noch optimiert werden, was die Schlüsselaufgaben und Ziele für die nächste Stufe betrifft. Wir haben das Expressionsniveau von Transgenen außerdem mittels qRT-PCR gemessen (Abb. 2d). Eine quantitative Echtzeit-PCR-Analyse (qRT-PCR) ergab, dass die Transkriptspiegel von SgSQE1, SgCS, SgEPH2, SgP450, SgUGT269-1 und SgUGT289-3 in den WT-Pflanzen deutlich höher waren. In diesem Assay variierte die Expression von 6 Transgenen in den Blättern und Früchten. Beispielsweise wurde in allen sechs Transgenen die relativ geringere SgSQE-Expression sowohl in den Blättern als auch in den Früchten nachgewiesen (Abb. 2d), die sich in der zweiten Genposition für das 2A-Peptidkonstrukt befand, das vom CaMV 35S-Promotor gesteuert wurde (ergänzende Abb. S2a). ). Das Genexpressionsniveau zwischen der ersten und der zweiten Genposition wurde häufig durch die Verwendung verschiedener 2A-Peptide beeinflusst43. Alles in allem deuteten PCR- und qRT-PCR-Nachweis darauf hin, dass die an der Mogroside-Biosynthese beteiligten Strukturgene in den transgenen Gurkenlinien exprimiert wurden. Schließlich wurde nur die transgene U1-Pflanze mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erworben.

eine genetische Transformation einer Gurke mit Agrobacterium, das den U22p-SCE-Vektor beherbergt. (1) Sterilisierte Samen. (2) 4 Tage alte Sämlinge. (3) Die Keimblätter wurden geschnitten und als Explantate verwendet. (4) Die Explantate im ausgewählten Medium. (5) Die regenerierten Pflanzen im Wurzelmedium. (6, 7) Regenerierte Pflanzen. b Blätter und Früchte der transgenen Gurkenlinie U1. c PCR-basierter Nachweis von U1. Die Spuren von links nach rechts repräsentieren Maker, WT, U1-Früchte und U1-Blätter. Ein Bild des DNA-Markers (4,5 kb) befindet sich in der unteren rechten Ecke der Abbildung. d Analyse auf Transkriptebene der transgenen Gurkenlinie U1 gemäß qRT-PCR. Das Csactin wird als interne Kontrolle verwendet. Die Expression von Gurken-WT-Pflanzen wurde auf 1 gesetzt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SDs, n = 3 biologisch unabhängige Proben dargestellt.

Auf Basis einer molekularen Analyse wurden die Zusammensetzung und der Gehalt an Mogrosiden in der transgenen Gurkenlinie mittels HPLC-ESI-MS/MS bestimmt. Mogrol-, MI-A1-, MII-E-, MIII-, SI- und MV-Standards wurden bei Retentionszeiten von 4,01, 19,38, 13,88, 12,03, 10,14 bzw. 0,8,37 Minuten nachgewiesen (Abb. 3a und ergänzende Abb. S4a). Wie in Abb. 3b und der ergänzenden Abb. S4b gezeigt, wurden Mogrol, MIA-1, MII-E, MIII und SI in transgenen Gurkenfrüchten und -blättern nachgewiesen, mit Ausnahme von MV, das nur in den Früchten gefunden wurde. MV sammelte sich in den Früchten auf ~587 ng/g Frischgewicht (FW) an, und der Gehalt der anderen Mogroside ist in Abb. 3b und der ergänzenden Abb. S4b aufgeführt. Mogroside wurden in den WT-Gurkenpflanzen nicht nachgewiesen. Darüber hinaus wurden die Metaboliten durch UPLC-ESI-QTOF-MS/MS weiter identifiziert, und die Gesamtionenchromatographie im Negativmodus ist in Abb. 4 dargestellt. Gemäß Retentionszeit, wahrem Molekulargewicht und Massenspektrometrie der Standards fünf Mogroside wurden in transgenen U1-Gurkenfrüchten beobachtet, einschließlich MI-A1, MII-E, MIII, SI und MV. Und [M + HCOO-H]- und [MH]- wurden häufig im MS/MS-Spektrum im Negativionenmodus beobachtet. Der Bruchmodus von MV war wie folgt: Die charakteristischen Fragmente bildeten leicht ein Molekül Ameisensäure, was im MS-Spektrum zu Produktionen bei m/z 1331,5443 führte. Die deprotonierten Ionen von [MH]- (m/z 1285,5507) wurden im MS/MS-Spektrum deutlich beobachtet (ergänzende Abbildung S5a). Darüber hinaus erhielt SI ein Molekül Ameisensäure mit [M + HCOO-H]- (m/z 1169,5096) und erzeugte ein deprotoniertes Ion [MH]- bei m/z 1123,5330 (Ergänzende Abbildung S5b). In ähnlicher Weise wurden basierend auf MS / MS-Spektren die Verbindungen 3, 4 und 5 als MIII, MII-E und MI-A1 identifiziert (ergänzende Abbildung S5c – e). Bemerkenswerterweise bestätigte das Vorhandensein von Mogrosiden, dass die gleichzeitige Expression der 6 Gene in der transgenen Gurkenlinie erfolgreich war. Süßgurken wurden erfolgreich durch die Rekonstruktion der Mogroside-Biosynthese in transgenen Gurken erzeugt. Interessanterweise erwies sich im U1-Blatt auch das Vorhandensein von Mogrosiden als großes Potenzial für die SI-Produktion unter Verwendung landwirtschaftlicher Abfälle. In unserer Studie haben wir eine praktische und hocheffiziente Multigen-Transformationsstrategie mithilfe der In-Fusions-Technologie und 2A-Peptidlinkern entwickelt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Strategie auf Gurken angewendet werden könnte und wichtige Auswirkungen erstens auf die Entwicklung Mogroside-anreichernder Gemüsesorten haben könnte.

eine HPLC-ESI-MS/MS-Analyse von Mogrosiden in der transgenen Gurkenlinie U1. Die schwarzen Pfeile zeigen den Peak der Mogroside an. b Akkumulation von Mogrosiden in der transgenen Gurkenlinie U1. nd, nicht erkannt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SDs, n = 3 biologisch unabhängige Proben dargestellt.

MIA-1, MII-E, MIII, SI und MV repräsentierten Mogrosid I-A1, Mogrosid II-E, Mogrosid III, Siamenosid I bzw. Mogrosid V.

In ähnlicher Weise wurde der Multigen-Vektor in Micro-Tom-Tomaten transformiert. Etwa 500 Explantate wurden im Assay transformiert und zwanzig transgene Hyg-resistente Tomatenlinien wurden durch mehrere Transformationsmethoden erzeugt. Unter ihnen wiesen nur vier Linien Gene im Zusammenhang mit der Mogroside-Biosynthese auf, die mittels PCR mit spezifischen Primern für die Gene SgSQE1, SgCS, SgEPH2, SgP450, SgUGT269-1, SgUGT289-3 und Hyg nachgewiesen wurden. Aus der genomischen DNA von vier in Frage kommenden transgenen Tomatenlinien wurden Fragmente der erwarteten Größe erhalten. Alle mit der Mogroside-Biosynthese zusammenhängenden Gene wurden aus diesen vier (S8, S10, S14 und S17) Linien der zwanzig mit dem U22p-SCE-Vektor transformierten Linien amplifiziert (Abb. 5a); In den WT-Pflanzen wurde keines der Zielgene beobachtet (Abb. 5b). Das heißt, dieser Multigenvektor wurde erfolgreich in das Tomatengenom eingeführt. Um die transgenen Linien weiter zu bestätigen, wurde das Expressionsniveau der Zielgene in den Linien S8, S10, S14 und S17 mittels qPCR untersucht (Abb. 5c). Alle mit der Mogroside-Biosynthese zusammenhängenden Gene wurden überexprimiert, obwohl in der S10-Linie relativ höhere Expressionsniveaus aller Gene auftraten (Abb. 5c). In den WT-Tomatenpflanzen wurden keine Transkripte der Zielgene nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass 6 Strukturgene, die an der Mogroside-Biosynthese beteiligt sind, in transgenen Tomatenfrüchten exprimiert wurden. Das heißt, der Mogroside-Weg wurde zunächst erfolgreich in die transgenen Tomatenpflanzen eingeführt.

a Micro-Tom-Tomaten-Wildtyp-Pflanzen (WT) und transgene Tomatenpflanzen. b PCR-basierte Analyse der transgenen Tomatenfrüchte. Die Spuren von links nach rechts repräsentieren den Maker, WT, S8, S10, S14 und S17. Ein Bild des DNA-Markers (4,5 kb) befindet sich in der unteren rechten Ecke der Abbildung. c Analyse des relativen Expressionsniveaus von 6 Mogroside-Biosynthesegenen in transgenen Tomatenfrüchten. Das Leactin wird als interne Kontrolle verwendet. Die Expression von Tomaten-WT-Pflanzen wurde auf 1 gesetzt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SDs, n = 3 biologisch unabhängige Proben dargestellt.

Die Produktion von Mogrosiden in den vier transgenen Tomatenfrüchten wurde mittels HPLC-ESI-MS/MS gemessen. Das extrahierte Ionenchromatogramm (EIC) der HPLC deutete darauf hin, dass sich eine kleine Menge MIII in der transgenen Tomatenlinie S10 ansammelte (Abb. 6a) und die Retentionszeiten mit denen der Mogroside-Standards übereinstimmten. In den WT-Anlagen wurde kein MIII nachgewiesen (Abb. 6a). Der Gehalt an MIII betrug 25,92 ng/g FW (Abb. 6b), und wir fanden auch eine kleine Menge an MI-A1 (5,65 ng/g), MII-E (2,33 ng/g), SI und MV. Der Gehalt an SI und MV liegt jedoch immer noch unter der Bestimmungsgrenze (

eine HPLC-ESI-MS/MS-Analyse von Mogrosiden in transgenen Tomatenfrüchten. b Anreicherung von MIII in transgenen Tomatenfrüchten. Die schwarzen Pfeile zeigen den Peak der Mogroside an. nd, nicht erkannt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SDs, n = 3 biologisch unabhängige Proben dargestellt.

Gurke ist ein allgemein nährstoffreiches Gemüse, hat aber einen milden Geschmack. Polyphenolverbindungen und Speichelproteine ​​verleihen Gurken einen leicht adstringierenden Geschmack, der manche Menschen dazu veranlasst, den Verzehr von Gurken zu meiden44,45. Um den Geschmack der Gurke zu verbessern, wurden die Mogroside-Biosynthesegene von Siraitia grosvenorii in Gurkenpflanzen transformiert, die ein Keimplasma mit Mogroside V produzieren. Und in den Früchten der transgenen Gurkenlinie U1, Mogrol, MI-A, MII-E, MIII und SI wurden gefunden und der Gehalt betrug 36,88, 58, 74,3, 615 bzw. 113 ng/g FW. Obwohl bekannt ist, dass Mogrosid IA-1, II-E bitter schmeckende Glykoside sind, sind SI und MV extrem süß, MIII ist geschmacklos oder leicht süß, wodurch Gurken einen süßen Geschmack, eine Geschmacksmischung oder völlig neue Geschmacksrichtungen erhalten bekanntes Gemüse. Und der Gehalt an MI-A und MII-E mit bitterem Geschmack war in den Früchten der transgenen Gurke zu gering, weshalb die Auswirkung auf den Geschmack der transgenen Gurke relativ gering ist. In ähnlicher Weise erzeugte die Transformation von Tomaten eine kleine Menge Mogrosid III in Tomaten. Der Gehalt an SI und MV liegt in den transgenen Tomatenlinien immer noch unter der Bestimmungsgrenze (

In unserer Studie zeigten die morphologischen Beobachtungsergebnisse transgener Tomatenpflanzen, dass in den vier unabhängigen transgenen Tomatenlinien schwere Zwergformen beobachtet wurden, bei den transgenen Gurkenpflanzen wurden jedoch keine offensichtlichen morphologischen Veränderungen festgestellt. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Mogroside das Pflanzenwachstum beeinflussen können, was zu metabolischen toxischen Wirkungen auf transgene Tomatenlinien führen kann. Die mögliche Erklärung für das Fehlen von Zwergwuchs bei Gurken ist, dass sowohl Gurke als auch Siraitia grosvenorii Kürbisgewächse sind und in der Gurke selbst viele Cucurbitan-Triterpen-Saponine wie Cucurbitacin B und Cucurbitacin C vorkommen und Mogroside ebenfalls Triterpen-Saponin sind, in diesem Fall Es gibt keine toxische Wirkung auf die transgenen Gurkenlinien. Darüber hinaus haben die meisten Studien laut früheren Untersuchungen gezeigt, dass die transgene Technik eine Stoffwechselstörung im Gibberellin-Metabolismus verursacht hat, was zu einer Zwergform in den transgenen Tomatenlinien führt52,53. Und die Einfügung transgener Gene führt häufig zu schlechtem Wachstum und schwerwiegenden Wachstumsstörungen bei transgenen Pflanzen. Frühere Studien haben beispielsweise gezeigt, dass die Integration von T-DNA in das Genom die Expression anderer unspezifischer Gene aktiviert oder inaktiviert, was zu physiologischen Störungen oder Pflanzenresistenz geführt hat in transgenen Pflanzen54,55. Daher haben wir spekuliert, dass die Zwergform der transgenen Tomate in dieser Studie möglicherweise mit den Veränderungen im Gibberellin-Metabolismus zusammenhängt, aber weitere Informationen werden in mehreren bevorstehenden Experimenten eingeführt.

Mithilfe der Multigentransformation können vollständige Stoffwechselwege in Pflanzen eingeführt werden. Im Gegensatz zu den zeitaufwändigen und langwierigen Schritten herkömmlicher Kreuzungs-, Retransformations- und Co-Transformationsmethoden56,57 bieten die neu entstehenden Multigen-Vektortransformationen und polycistronischen Transgene hervorragende Vorteile. Insbesondere ermöglicht die Transformation mehrerer Vektoren die Zusammenstellung mehrerer Genexpressionskassetten in einer einzigen T-DNA-Region und die Integration in das Genom des Wirtschromosoms57,58. Bisher gibt es keine Hinweise darauf, dass die maximale Anzahl an Transgenen in Pflanzen eingeführt werden kann, und dennoch wurden nur wenige Untersuchungen zu sechs oder mehr Transgentransformationen in einem einzigen Vektor durchgeführt. Darüber hinaus können instabile binäre Vektoren mit steigender Anzahl an Transgenen einen spontanen Genverlust in heterologen Pflanzen auslösen59,60. Daher war der schematische Aufbau der Multigen-Vektoranordnung in dieser Forschung wichtig. Das Transgene Stacking II-System (TGS II)61,62, das Gateway-Rekombinationssystem63,64, die Gibson-Assembly65,66 und die In-Fusion-Technologie67 wurden häufig bei der Multigen-Vektorassemblierung eingesetzt. Unter diesen bleibt das Gateway-Rekombinationssystem aufgrund von Betriebsschwierigkeiten eine Herausforderung im Hinblick auf den Zusammenbau von mehr als fünf Genen. Auf dieser Grundlage wurde kürzlich TGS II als praktischeres und effizienteres Multigen-Vektorsystem entwickelt, mit dem 4–8 Gene in heterologe Pflanzen transformiert werden können68. Die Gibson-Assembly- und In-Fusion-Technologie wird häufig verwendet, um mehrere überlappende DNA-Fragmente gleichzeitig in einer einzigen Reaktion zu fusionieren. Darüber hinaus beträgt die maximale Vektorgröße der In-Fusion-Technologie 46 kb. Daher ermöglicht die In-Fusion-Technologie die Zusammenstellung mehrerer Genexpressionskassetten. Unter Berücksichtigung repetitiver Sequenzen in einem Multigen-Vektor wurden selbstspaltende 2A-Peptide (16 bis 20 Aminosäuren) eingeführt, die im Vergleich zu anderen Strategien zur Multi-Gen-Expression zu relativ hohen Graden der Downstream-Proteinexpression führen69,70,71. Allerdings wird die Effizienz der Proteinexpression durch unterschiedliche 2A-Sequenzen vermittelt. In dieser Studie waren die Transkriptniveaus von SgSQE1, SgCS, SgEPH2, SgP450, SgUGT269-1 und SgUGT289-3 in den transgenen Gurkenblättern und -früchten unterschiedlich. Ein möglicher Grund ist, dass die meisten Transgene von einem konstitutiven Promotor, dem CaMV 35S-Promotor, gesteuert werden, was deutliche Unterschiede in der Transkriptionsaktivität je nach Gewebe- und Organtyp zeigte72,73,74,75,76. Der CaMV 35S-Promotor trieb die β-Glucuronidase (GUS)-Aktivität voran, die in Birkenwurzeln und Achselknospen höher war als in anderen Birkenorganen75. Das vom CaMV 35S-Promotor gesteuerte grüne Fluoreszenzprotein (GFP) hatte in den Gefäßgeweben der Tabakblätter eine höhere Aktivität als in anderen Geweben74. Und auch physiologische Bedingungen und abiotischer Stress beeinflussten die Expression der Zieltransgene. Um eine hohe und stabile Transgenaktivität sicherzustellen, sollte daher der Konstruktion und den Wachstumsbedingungen des Multigenvektors weiterhin große Aufmerksamkeit gewidmet werden.

Zusammenfassend wurde eine auf In-Fusion basierende Gen-Stacking-Strategie für das Transgen-Stacking entwickelt, 6 Mogroside-Biosynthesegene wurden in Gurken und Tomaten sowie transgene süße Gurken mit Mogrosid V und leicht süße Tomaten mit Mogrosid III übertragen. Diese Studie zeigt das große Potenzial der genetischen Verbesserung frisch verzehrter Süßpflanzen. Unsere Arbeit verändert das traditionelle Muster der Züchtung süßer Geschmacksrichtungen grundlegend und bietet einen hervorragenden Weg zur Umwandlung von süßen Bestandteilen ohne Zucker und ohne Protein, anstatt den Zuckergehalt in frischem Gemüse zu erhöhen. Darüber hinaus bietet diese Studie eine Möglichkeit für die heterologe Biosynthese von Mogrosiden.

Cucumis sativus (JinYan 4, ZY4) und Lycopersicon esculentum (Micro-Tom) wurden zur Pflanzentransformation verwendet. Experimente zur vorübergehenden Expression wurden in Cucumis sativus ZY4 und Tabak durchgeführt. In diesem Experiment wurden die Escherichia coli-Stämme DH5α und XL10-Gold (WeidiBio, Shanghai, China) und für die Transformation der Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 verwendet.

Geeignete Promotoren sind entscheidend für die Expression von Zielgenen in Multigen-Vektoren. Ubiquitin 10-AtUBQ10- und Serin-Carboxypeptidase-ähnliche AtSCPL30-Promotoren (AtPD7, 456 bp) wurden aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung von KOD One PCR Master Mix (TOYOBO CO., LTD., Japan) kloniert. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: anfängliche Aktivierung bei 98 °C für 5 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen bei 98 °C für 10 Sekunden, Annealing-Temperatur –5 °C für 5 Sekunden und 68 °C für 10 s/kb und eine abschließende Verlängerung bei 68 °C für 7 Minuten. Um die Vektoren AtUBQ10:β-Glucuronidase (GUS) und AtPD7:GUS zu konstruieren, wurde jeder dieser Promotoren an XbaI/BamHI-Restriktionsstellen mit einem pBI121-Plasmid fusioniert (Abb. 1b). Die Primer sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt. Die resultierenden rekombinanten Plasmide wurden durch Sequenzierung bestätigt. In dieser Studie wurde pBI121, gesteuert durch den Promotor des 35S-Blumenkohlmosaikvirus (CaMV 35S), als Positivkontrolle verwendet. Alle Plasmide wurden in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 transformiert und für transiente Tests in Cucumis sativus und Nicotiana benthamiana verwendet.

Die cDNA von Siraitia grosvenorii-Früchten wurde verwendet, um die kodierenden Sequenzen von SgSQE1 (Squalen-Epoxidase), SgCS (Cucurbitadienol-Synthase), SgEPH2 (Epoxid-Hydrolasen), SgP450 (Cytochrom-P450-Monooxygenase), SgUGT269-1 und SgUGT289-3 (UDP-Glucosyltransferasen) zu amplifizieren )29. Um die Expression aller Gene zu initiieren, wurde der CaMV 35S-Promotor aus dem pBI121-Plasmid isoliert und die AtUBQ10- und AtPD7-Promotoren aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung von KOD One PCR Master Mix amplifiziert. Was die Transkriptionsterminatoren betrifft, so wurden Nopalinsynthase (NOS)-Terminatoren aus pBI121 erhalten, und Mannopinsynthase (MAS)-Terminatoren und Hitzeschockprotein (HSP) 18.2-Terminatoren wurden von GENEWIZ (Suzhou, China) chemisch synthetisiert.

In der ersten Runde der Genassemblierung wurde jedes dieser mit der Mogroside-Biosynthese zusammenhängenden Gene über Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) und dann SgCS, SgEPH2, SgP450 und SgUGT289 amplifiziert. 3 wurden mit einem ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) in die BamHI- und SacI-Stellen des pBI121-Vektors ligiert. SgSQE1, fusioniert mit dem AtPD7-Promotor und dem HSP-Terminator, und SgUgt269-1 wurden zusammen mit dem AtUBQ10-Promotor und dem MAS-Terminator in pBI121 an den HindIII- und EcoRI-Stellen unter Verwendung eines ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China). PD7:SgSQE1:Thsp, 35S:SgCS:Tnos, 35S:SgEPH2:Tnos, 35S:SgP450:Tnos, 35S:SgUGT289-3:Tnos und UBQ10:SgUGT269-1:Tmas wurden generiert. In der zweiten Runde der Genassemblierung wurde jede der ersten Genexpressionskassetten, die den Promotor, das Zielgen und den Terminator enthielt, über KOD One PCR Master Mix kloniert. PD7:SgSQE1:Thsp und 35S:SgCS:Tnos wurden über ein ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit an den EcoRI/HindIII-Restriktionsstellen eines pCAMBIA1300-Binärplasmids eingefügt. In ähnlicher Weise wurden UBQ:SgUGT269-1:Tmas und 35S::SgUGT289-3:Tnos in die gleichen Restriktionsstellen des pCAMBIA1300-Plasmids ligiert, was eine doppelte Genexpressionskassette ergab. In der dritten Runde der Genassemblierung wurden die Regionen PD7:SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos und 35S:SgEPH2:Tnos durch PCR amplifiziert und in UBQ10:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289 subkloniert. 3: Tnos EcoRI/HindIII-Stellen eines pCAMBIA1300-Plasmids. Anschließend wurden die Sequenzen UBQ10:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos und 35S:SgP450:Tnos isoliert und in das pCAMBIA1300-Plasmid eingefügt, und dreifache Genexpressionskassetten wurden konstruiert. Anschließend wurde in der letzten Runde der Genassemblierung die 6,1-kb-Sequenz von UBQ10:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos::35S:SgP450 und SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos:: 35S:SgEPH2:Tnos (6,5 kb) wurden aus den Triple-Gen-Expressionskassetten isoliert. Für den endgültigen Multigen-Expressionsvektor wurden die oben genannten Fragmente über ein ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China). Dieser endgültige Vektor wurde in dieser Studie als U22p-SCE-Vektor bezeichnet (ergänzende Abbildung S2a). Alle für die Multi-Gen-Vektorkonstruktion verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt.

Um die Multigen-Expressionsvektoren zu verifizieren und die Promotoraktivität zu analysieren, wurde ein transienter Expressionstest in Cucumis sativus ZY4 und Tabak durchgeführt. Ein Multigen-Expressionsvektor wurde durch die Gefrier-Auftau-Methode in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 transformiert. Die transformierten Agrobacterium-Stämme wurden bei 28 °C in LB-Medium, ergänzt mit Rifampicin und Kanamycin, kultiviert, bis die OD600 der Bakterien 0,6 erreichte. Alle Kulturen wurden 10 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert, in Puffer resuspendiert, der 10 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), 10 mM MgSO4 und 200 μM Acetosyringon (AS) enthielt, und dann 2–2 Minuten lang inkubiert. 4 Stunden bei Raumtemperatur. Mit der Suspension wurden Keimblätter von 8 Tage alten Cucumis sativus ZY4-Pflanzen und Blätter von Nicotiana benthamiana (Positivkontrolle) mit einer nadellosen Spritze infiziert. Um die Genauigkeit sicherzustellen, wurden die transienten Expressionsverfahren unabhängig voneinander zehnmal wiederholt.

Proben von Nicotiana benthamiana wurden 48 Stunden nach der Infiltration entnommen, und Keimblätter von Cucumis sativus ZY4 wurden 1, 3, 5 und 7 Tage für histochemische GUS-Färbungsanalysen gemäß einem früheren Protokoll entnommen. Die Bilder wurden mit einer Canon EOS 80D aufgenommen. Die Bilder wurden verwendet, um die Intensität der Blaufärbung zu bestimmen. Dieses Experiment wurde unabhängig voneinander zehnmal wiederholt.

Die Samen der Cucumis sativus-Linie ZY4 wurden 15 Minuten lang bei 55 °C eingeweicht und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Gurkensamen wurden nach Trulson et al. sterilisiert. mit geringfügiger Änderung77. Nach dem Einweichen wurden die Samen 30 Sekunden lang mit 75 % Alkohol sterilisiert, gefolgt von 15 Minuten lang mit 3 % NaClO, dann fünfmal mit sterilem Wasser gewaschen und 3 Tage lang im Dunkeln auf Murashige und Skoog (MS) beimpft. Um gentechnisch veränderte Gurken zu erhalten, verwendeten wir die Keimblätter der 4 Tage alten Cucumis sativus (Gurke) als Explantate. Die Keimblätter wurden von den Sämlingen abgeschnitten und der Wachstumspunkt entfernt. Die Explantate wurden 1 Tag lang im Dunkeln auf das Vorkultivierungsmedium, MS-Medium mit 1 mg/L 6-Benzylaminopurin (6-BA), 0,5 mg/L Abscisinsäure (ABA) und 2 mg/L AgNO3, gelegt. Anschließend wurden die Explantate 30 Minuten lang mit Agrobacterium infiziert, das den Multigen-Expressionsvektor enthielt. und auf Co-Kultivierungsmedien (MS-Medium mit 1 mg/L 6-BA, 0,5 mg/L ABA, 2 mg/L AgNO3 und 1,45 mg/L AS) für 2 Tage im Dunkeln bei 25 °C kokultiviert. Nach der Kokultivierung wurden die Explantate in selektivem Medium (MS-Medium mit 1 mg/L 6-BA, 0,5 mg/L ABA, 2 mg/L AgNO3, 500 mg/L Cefotaxim-Natrium (Cef) und 5 oder 8 mg kultiviert /L Hygromycin (Hyg) unter 18 Stunden Licht/6 Stunden Dunkelheit). Zur Selektion der transformierten Pflanzen wurde Hyg (5 mg/L) verwendet. Calli wuchsen auf MS-Medium, ergänzt mit Hyg (8 mg/L). Im Allgemeinen wurden die aus den erreichten Kalli entstandenen Adventivsprosse zu grünen und gesunden Explantaten regeneriert. Anschließend wurden 2–3 cm große Segmente der Regeneranten für die Kultivierung in Bewurzelungsmedien, ergänzt mit 10 mg/L Hyg, ausgewählt. Nach einem Monat Kultivierung wurden die regenerierten Gurkensämlinge in vivo herausgeschnitten und dann in einem Gewächshaus kultiviert (Abb. 2a). Danach wurden die Kallus- und Regenerationspflanzen durch kontinuierliche Subkultur gewonnen. Um transgene Linien zu erhalten, wurden die Regenerationspflanzen auf Wurzelmedien (MS-Medium mit 1 mg/L Gibberellin A3 (GA3), 400 mg/L Cef) kultiviert. Die regenerierten Pflanzen wurden in einem Gewächshaus bei 28 °C unter 18 h/6 h (hell/dunkel) kultiviert.

Die genetische Transformation wurde nach Sun et al. durchgeführt. mit Modifikation78. Samen von Micro-Tom wurden 30 Sekunden lang in 70 % Ethanol und 10 Minuten lang in 10 % NaClO sterilisiert, viermal mit sterilisiertem Wasser gespült und auf sterilisiertem Filterpapier getrocknet. Die Samen wurden in den MS-Medien gekeimt. Unter Verwendung der Blätter, Keimblätter und Hypokotyle von 10 Tage alten Micro-Tom-Pflanzen als Explantate wurden Blätter und Keimblätter in Stücke von etwa 0,5 cm × 0,5 cm geschnitten, die Hypokotyle wurden in Segmente von etwa 0,5–0,6 cm geschnitten, um ihnen dies zu ermöglichen Adsorbieren Sie die Bakteriensuspension. Sie wurden 24 Stunden lang auf dem Vorkultivierungsmedium (MS-Medium mit 1 mg/L 6-BA und 0,2 mg/L NAA) vorkultiviert. Nach der Vorkultivierung wurden die Explantate 30 Minuten lang mit Agrobacterium inkubiert, das den Multigen-Expressionsvektor enthielt, und dann auf Co-Kultivierungsmedien (MS-Medium mit 1 mg/l 6-BA, 0,2 mg/l NAA und 0,1 mM AS) übertragen 2 Tage. Anschließend wurden die Explantate auf Selektionsmedien (2,0 mg/L Zeatin (ZT), 0,2 mg/L Indolessigsäure (IAA), 10 mg/L Hyg und 500 mg/L Carbenicillin) übertragen. Anschließend wurden die Knospen in Elongationsmedium (1,0 mg/L ZT, 0,05 mg/L IAA, 500 mg/L Cef, 10 mg/L Hyg und 500 mg/L Carbenicillin) überführt und man ließ die regenerierten Triebe wachsen eine Länge von 1 cm. Anschließend wurden die Triebe in Wurzelkulturmedien überführt, die aus 1/2-starkem MS-Medium mit 0,1 mg/L IAA, 2 mg/L Hyg, 500 mg/L Cef und 500 mg/L Carbenicillin bestanden.

Genomische DNA wurde aus den transgenen Linien unter Verwendung eines Plant Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking) erhalten. Zur Verifizierung der transgenen Pflanzen wurde eine genomische PCR mit KOD One PCR Master Mix durchgeführt. Darüber hinaus wurde genomische PCR verwendet, um die durch Hyg-Resistenz-Screening erhaltenen transgenen Linien nachzuweisen. Als Negativkontrolle wurde genomische Wildtyp-DNA (WT) von Pflanzen verwendet. Alle für den PCR-Nachweis verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt.

Gesamt-RNA wurde aus den Blättern der transgenen Pflanzen mit einem CWBIO-RNA-Extraktionskit (CWBIO. Co., Ltd., Peking, China) isoliert und 1 μg Gesamt-RNA wurde zur Umkehrtranskription von cDNA über TransScript® One-Step gDNA verwendet Entfernung und cDNA-Synthese SuperMix (Transgen, Peking, China). Für die quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) wurde PerfectStartTM Green qPCR SuperMix (Transgen, Peking, China) in Verbindung mit einem ABI CFX96TM Real-Time System (USA) verwendet, um die Expressionsniveaus gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren. Der Temperaturwechsel war wie folgt: (1) 95 °C für 30 s; (2) 40 Zyklen 3-sekündiger Denaturierung bei 95 °C, 10-sekündiges Tempern bei 55 °C; (3) Dissoziationskurve bestehend aus 15 s Inkubation bei 95 °C, 60 s Inkubation bei 60 °C, einem Anstieg auf 95 °C. Die Gentranskriptspiegel wurden mit der 2-ΔΔCT-Methode präzise für die Zielgenexpression quantifiziert, und Csactin und Leactin wurden als interne Kontrolle verwendet. Dieses Experiment wurde für mehrere technische Replikate durchgeführt. Alle für die qRT-PCR verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S5 aufgeführt.

Alle Proben wurden in flüssigem Stickstoff gemahlen (Gurke, 10 g und Tomate, 4 g) und in 10 ml bzw. 4 ml 80 %iger Methanollösung homogenisiert. Anschließend wurde eine ultraschallwasserbadunterstützte Extraktion 1 Stunde lang bei Raumtemperatur und 40 kHz durchgeführt und 20 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand gesammelt und mit einem 0,22 µM Millipore-Filter filtriert.

Für die quantitative Analyse von Mogrosiden und Mogrolgehalten werden ein AB SCIEX QTRAP 4500 LC-MS/MS-System (AB SCIEX, Toronto, Kanada) und ein Agilent Technologies 1260 Series LC-System (Agilent, USA) verwendet, ausgestattet mit einer Agilent Poroshell 120 SB C18-Säule (100 mm × 2,1 mm, 2,7 µm) wurden verwendet. Die mobile Phase bestand aus (A) Wasser (einschließlich 0,1 % Ameisensäure) und (B) Acetonitril (einschließlich 0,1 % Ameisensäure) mit einer Gradientenelution. Die HPLC-Bedingungen für Mogroside waren wie folgt: 0 Min., 20 % B; 3–5 Min., 23 % B; 18 Min., 40 % B; und 18,01–20,10 Min., 20 % B. Die Flussrate betrug 0,25 ml/Min. Für Mogrol waren die HPLC-Bedingungen wie folgt: 0 Min., 20 % B; 0,5 Min. 30 % B; 2–4 Min., 88 % B; und 5,50–8,00 min, 20 % B. Die HPLC-ESI-MS/MS-Parameter sind in Tabelle 1 aufgeführt, und in dieser Studie wurde Elektrospray-Ionisation (ESI) mit Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Scanning verwendet. Jedes Experiment wurde dreimal durchgeführt. Die beiden oben genannten Methoden wurden in unserer vorherigen Arbeit für die quantitative Analyse entwickelt und eignen sich für die genaue Quantifizierung der Zielkomponenten in dieser Studie. Die quantitativen Analysen wurden mittels einer externen Standardmethode79,80 durchgeführt.

Alle Standards, einschließlich Mogrosid I-A1 (MI-A1), Mogrosid II-E (MII-E), Mogrosid III (MIII), Siamenosid I (SI), Mogrosid V (MV) und Mogrol, wurden von Chengdu Must Bio-Technology gekauft Co., Ltd. (Sichuan, China) gelöst und in Methanol gelöst.

Um Metaboliten in transgenen Pflanzen zu identifizieren, wurden sie mit einem UPLC-ESI-QTOF-MS/MS-System (Waters Corp.) mit negativer Elektrospray-Ionisation (ESI) analysiert. Die MS-Bedingungen waren im MSE-Kontinuumsmodus mit einem Scanbereich von m/z 100 bis 1500. Die Kollisionsspannung betrug 2,5 KV. Die Spannung am Probenkegel und am Extraktor betrugen 40 KV bzw. 4 KV. Die Quellentemperatur und die Desolvatisierungstemperatur betrugen 100 °C bzw. 250 °C. Der Kegelgasfluss betrug 50 l/h und der Desolvatisierungsgasfluss betrug 600 l/h; Für die Erfassung von MS/MS-Daten wurde die Kollisionsenergie von 15 auf 45 eV erhöht. Für die Datenerfassung und -verarbeitung wurde die Software Masslynx 4.1 verwendet.

Die quantitativen Echtzeitanalysedaten werden in der Arbeit als Mittelwert ± SEM von mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Proben zufällig entnommen und alle unabhängigen Proben oder Experimente wurden mehr als dreimal wiederholt. Die Durchschnittswerte und Standardabweichungen wurden mit dem Statistikprogramm SPSS 16.0 (IBM Co., Armonk, New York, USA) berechnet. Alle Diagramme wurden mit Origin 2019b (OriginLab Co., Northampton, MA, USA) erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Unverarbeitete Blotbilder sind in der ergänzenden Abbildung S7 dargestellt. Die Quelldaten für die Abbildungen finden Sie in den Zusatzdaten 1. Dieses Plasmid Up-SCE ist über den Addgene-Katalog Nr. 197269 erhältlich. Alle anderen relevanten Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (U20A2004; 81973413; 82104548), dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2019-1007-15; 2021-I2M-1-071) und der Science und Technologie-Großprojekt von Guangxi (GuiKeAA19254025).

Jingjing Liao

Aktuelle Adresse: The Artemisinin Research Center, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Peking, 100700, China

Institut für Heilpflanzenentwicklung, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften und Peking Union Medical College, Peking, 100193, China

Jingjing Liao, Lei Xie, Jing Qiao, Shengrong Cui, Xunli Jia, Zuliang Luo und Xiaojun Ma

Hochschule für Gartenbau, Shenyang Agricultural University, Shenyang, 110866, China

Tingyao Liu

Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, 530007, China

Changming Mo

Guangxi Key Laboratory of Plant Functional Phytochemicals and Sustainable Utilization, Guangxi Institute of Botany, Autonome Region Guangxi Zhuang und Chinesische Akademie der Wissenschaften, Guilin, 541006, China

Xiyang Huang

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JL, XM und JQ haben diese Studie konzipiert. JL, TL und LX konstruierten Multigen-Vektor. JL, CM und XH führten den Pflanzentransformationstest durch. SC, JL und XJ führten den PCR-Nachweis und die qRT-PCR-Analyse durch. ZL hat die Mogroside-Komponenten in den transgenen Pflanzen nachgewiesen. XM betreute das Projekt. JL hat das Manuskript verfasst. XM, ZL und TL haben das Manuskript überarbeitet.

Korrespondenz mit Zuliang Luo oder Xiaojun Ma.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Oswaldo Hernandez-Hernandez, Ana Munoz und Yoshihiko Nanasato für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Leena Tripathi und Joao Valente. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Liao, J., Liu, T., Xie, L. et al. Heterologe Mogroside-Biosynthese in Gurken und Tomaten durch genetische Manipulation. Commun Biol 6, 191 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04553-3

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Eingegangen: 22. Mai 2022

Angenommen: 03. Februar 2023

Veröffentlicht: 17. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04553-3

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