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Aug 06, 2023

Verbesserte Trockenheitstoleranz von EMS-mutagenisierten Alfalfa-Mutanten (Medicago sativa L.) durch In-vitro-Screening im Keimungsstadium

Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12693 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Ziele dieser Studie bestanden darin, dürretolerante neue Genotypen von Luzernenmutanten (Medicago sativa L.) zu bestimmen, indem EMS-mutagenisierte 340675 M3-Samen im Keimungsstadium in Gegenwart von osmotischem Stress von 35 % PEG6000 gescreent wurden. Der Wurzelwachstumstest lieferte mehrere dürretolerante Mutantenkandidaten. Davon wurden 4 Mutanten weiter unter Wassermangelbedingungen untersucht, die 24 Tage nach dem ersten Schnitt im Blütenknospenstadium angewendet wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass Mutanten, die im Keimungsstadium als dürretolerant eingestuft wurden, auch gegenüber Wassermangelbedingungen tolerant waren. Es wurde festgestellt, dass der Proteingehalt und die Superoxiddismutasewerte bei allen Mutanten höher waren als bei den Kontrollen. Die Werte für Ascorbatperoxide, Vielfraßreduktase und Lipidperoxidase variierten je nach mutiertem Genotyp und Dauer des Trockenstresses. Trockenstress veränderte die Transkriptionsniveaus der Gene MtP5CS, MtDehyd, MseIF-2, MtRD2 und MsNAC signifikant. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das In-vitro-Screening von Luzerne-Mutantensamen auf osmatische Toleranz bei der Keimung und in den frühen Wachstumsstadien der Sämlinge erfolgreich die dürretoleranten Luzerne-Mutanten bestimmen konnte, die nach dem ersten Schnitt im Blütenknospenstadium auch gegenüber Wassermangelbedingungen tolerant waren.

Die globale Erwärmung bedroht die heutige landwirtschaftliche Produktion, indem sie das für die Pflanzenproduktion benötigte Bewässerungswasser begrenzt1. Daher ist die Entwicklung neuer Pflanzensorten, die Dürrestressbedingungen besser tolerieren und Ertragsverluste minimieren können, von strategischer Bedeutung für die Gewährleistung der Ernährungssicherheit künftiger Generationen. Allerdings ist die komplexe Struktur des Trockenstressmechanismus einer der wichtigsten Gründe für den langsamen Fortschritt der Zuchtstudien2. Dürretoleranz zeigt eine quantitative Vererbung, die durch mehrere Gene gesteuert wird3. Die epistatischen und pleiotropen Beziehungen zwischen diesen Genen machen es außerdem äußerst schwierig, sie für Zuchtstudien in die Praxis umzusetzen3. Darüber hinaus sind Faktoren wie Entwicklungszeiten einer Pflanze, Dauer und Schwere von Stress auch wichtige Determinanten für die Bewertung des Ausmaßes der quantitativen Vererbung von Trockenstress4.

Trockenheitstolerante Pflanzen können ihre normalen Funktionen auch bei Bedingungen mit niedrigem Wasserpotential erfüllen5. Pflanzen nutzen unter Wassermangelbedingungen verschiedene Strategien, um schädliche Auswirkungen von Trockenstress auf physiologischer, morphologischer und transkriptioneller Ebene zu minimieren. Pflanzen nutzen auch eine Fluchtstrategie, die als die Fähigkeit von Pflanzen definiert ist, unter Dürrebedingungen ein hohes Wasserpotenzial aufrechtzuerhalten. Diese Strategie wird im Allgemeinen durch einige agromorphologische Veränderungen bei Pflanzen ermöglicht, wie z. B. die Verringerung der Blattfläche, die Verringerung der Anzahl und Leitfähigkeit der Stomata, die Bildung dichter Wurzelsysteme und die Erhöhung des Wurzel-Stamm-Verhältnisses6.

Luzerne (Medicago sativa L.) ist eine wichtige Futterpflanze und hat weltweit eine erhebliche wirtschaftliche Bedeutung, da sie auf verschiedene Weise einen unschätzbaren Beitrag zur nachhaltigen Landwirtschaft und Tierhaltung leistet7, einschließlich hoher Heuerträge, hervorragender Nährstoffqualität und Fähigkeit zur Stickstofffixierung8. Innerhalb der Luzerne-Art kultivierte Sorten sind autotetraploid mit nahezu identischen Genomen9. Die Luzerne erweist sich aufgrund ihres tiefen Wurzelsystems, das im Allgemeinen in den wenigen Jahren nach der Pflanzung ausgeprägt ist, allgemein als dürretolerant10. Neben der Keimung und dem frühen Keimlingswachstum ist jedoch auch das Wiederwachstumsstadium der Luzerne unmittelbar nach dem Schneiden im Pflanzjahr sehr anfällig für Trockenstress. Darüber hinaus benötigt Luzerne im Vergleich zu anderen Kulturpflanzen insbesondere in Trockengebieten deutlich mehr Bewässerungswasser, da sie mehrmals geerntet wird und das ertragreichste Futter in einer Vegetationsperiode liefert.

Obwohl bei der Entwicklung neuer Luzernesorten, die verschiedene abiotische Belastungen, einschließlich Dürre, tolerieren, teilweise Erfolge erzielt wurden11, wurden im Vergleich zu anderen wichtigen Nutzpflanzenarten nur sehr begrenzte Fortschritte erzielt12. Darüber hinaus hängt die Identifizierung toleranter Pflanzen gegen Trockenstress durch direkte Selektion hauptsächlich von der genetischen Variation des verwendeten Materials und dem Erfolg der Screening-Methoden ab. Es scheint sehr schwierig zu sein, neue dürretolerante Luzerne-Genotypen zu entwickeln, indem man Kreuzungsmethoden anwendet und die vorhandene schmale genetische Basis von Luzerne untersucht13. Deshalb haben wir die Ethylmethansulfonat (EMS)-Mutagenese genutzt, um eine neuartige genetische Variation zu schaffen. Das Screening von M3-Mutantensamen im Keimungsstadium unter In-vitro-Bedingungen ergab mehrere dürretolerante Kandidaten. Vier von ihnen wurden auch auf physiologischer, morphologischer und transkriptioneller Ebene unter Wassermangelbedingungen neu bewertet, die 24 Tage nach dem ersten Schnitt im Blütenknospenstadium angewendet wurden, was auch als ein weiteres kritisches Stadium zur Bestimmung der Nachwuchsleistung von Luzerne unter beiden angesehen wurde bewässerte und unbewässerte Wachstumsbedingungen. Die Trockenstressreaktionen der Mutanten wurden mit bewässerten und unbewässerten Kontrollpflanzen verglichen.

Das Screening von 340675 M3-Samen in der Keimung und im frühen Keimlingswachstumsstadium in Gegenwart von osmotischem Stress durch 35 % PEG6000 ergab mehrere dürretolerante Kandidaten (Abb. 1). Davon wurden 4 Mutanten weiter auf ihre Nachwuchsleistung unter Wassermangelbedingungen getestet, die 24 Tage nach dem ersten Schnitt im Blütenknospenstadium angewendet wurden, und die Ergebnisse wurden sowohl mit bewässerten (Z1) als auch mit unbewässerten Kontrollpflanzen (Z2) verglichen (Tabelle 1). ).

Screening mutierter M3-Samen und entwickelter Sämlinge. (A) Nahansicht der gepflanzten Samen auf dem rohen MS-Medium, das 35 % PEG6000 enthält. (B) *, nicht mutierte Kontrollsamen; **, mutierte M3-Samen. (C–D) Mutantenkeimlingskandidaten aus dem Screening. Pfeile zeigen Keimwurzelverlängerungen. (E–F) Sämlinge aus MS-Medium gerettet und in Violen gepflanzt. (G–H) Sämlinge in einen Plastiktopf gepflanzt und die Pflanze entwickelte sich im Stadium der Blütenknospe.

Die Ergebnisse der agromorphologischen Parameter zeigten nicht nur wichtige Unterschiede innerhalb der M3-Mutanten, sondern zeigten auch signifikante Unterschiede im Vergleich zu den Kontrollpflanzen (Tabelle 1). Die Pflanzenhöhe der Mutanten am 18. Tag des Trockenstresses lag zwischen 36,3 cm und 45,7 cm, während die Z1- und Z2-Kontrollen eine Pflanzenhöhe von 42,1 cm bzw. 38 cm aufwiesen (Tabelle 1). Bei einer Verlängerung des Trockenstresses auf 24 Tage ergaben alle Mutanten mit einer Ausnahme (Mutante Y20) eine größere Pflanzenhöhe als die Kontrolle Z2 (52,0 cm). Der Hauptstamm hat sich im Allgemeinen verdickt, da sich der Trockenstress vom 18. bis zum 24. Tag ausdehnte, mit Ausnahme der Mutante Y20 und der Kontrolle Z2 (Tabelle 1). Die Auswirkungen von Trockenstress auf die natürliche Pflanzenhöhe von Mutanten variierten je nach Dürredauer. Die Anzahl der Seitenzweige lag am 18. bzw. 24. Tag des Trockenstresses zwischen 2 und 9 bzw. zwischen 4 und 11 pro Pflanze. Mit Ausnahme der Mutante Y20 erhöhte die Dauer des Trockenstresses die Anzahl der Seitenzweige in allen Mutanten sowie in den Kontrollpflanzen (Tabelle 1). Die Anzahl der Blätter pro Pflanze stieg bei den Kontrollen und der mutierten X6-Pflanze, während bei den Mutanten Y20, Y25 und Y35 eine verringerte Anzahl der Blätter pro Pflanze festgestellt wurde, wenn der Trockenstress vom 18. auf den 24. Tag verlängert wurde (Tabelle 1). Der Trockenstress reduzierte die Länge und Breite der mittleren Blättchen bei allen Mutanten und den Kontrollen am 18. und 24. Tag des Trockenstresses (Tabelle 1). Allerdings war die Reduktionsrate bei den Mutanten geringer als bei der Kontroll-Z2-Pflanze (Tabelle 1). Es wurde festgestellt, dass die Temperaturen im Pflanzendach zwischen den Kontrollen und den Mutanten am 18. und 24. Tag des Trockenstresses signifikant unterschiedlich waren (Tabelle 1). Die Mutanten Y20 und Y30 hatten am 18. Tag des Dürrestresses eine niedrigere Temperatur im Blätterdach als beide Kontrollen, während die Temperatur im Blätterdach des Mutanten Y20 am 24. Tag des Dürrestresses deutlich niedriger war als bei den anderen Mutanten (Tabelle 1). Die höchste Anzahl an Samen pro Schote (2 Samen/Schote) und der höchste Samenertrag pro Pflanze (1,34 g/Pflanze) wurden von der Mutante X6 erhalten, während die Mutante Y35 keine Samen ergab (Tabelle 1). Die Blütenfarbe der Mutanten variierte von rosa bis violett, während die Kontrollen nur eine rosa Farbe aufwiesen (Tabelle 1).

Trockenstress reduzierte den Proteingehalt von Luzerne signifikant (p < 0,001) (Abb. 2A). Es wurde jedoch festgestellt, dass der Gesamtproteingehalt der Mutanten Y20 und Y30 höher war als bei beiden Kontrollpflanzen (Z1 und Z2), während die Mutanten X6 und Y35 mit der bewässerten Kontrolle (Z1) den gleichen Proteingehalt aufwiesen (Abb. 2B). Innerhalb der Mutanten ergab die Mutante Y20 den höchsten Gesamtproteingehalt (100,68 mg/ml), während die Mutante Y35 über alle Zeitintervalle hinweg den niedrigsten Gesamtproteingehalt (66,04 mg/ml) aufwies (Abb. 2B). Die Proteingehalte der Mutante Y20 stiegen im Verlauf der Trockenstressperiode signifikant an, während sie bei der Mutante Y30 in allen getesteten Zeitintervallen stabil blieben (Abb. 2C). Die höchsten Proteinwerte (104,9 mg/ml und 118,60 mg/ml) wurden von der Mutante Y20 erhalten, während die Kontrolle Z2 25,30 mg/ml bzw. 35,75 mg/ml am 18. bzw. 24. Tag des Trockenstresses aufwies (Abb. 2C). ).

Proteingehalt. (A) Gesamteffekte von Trockenstress auf Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, n = 18. (B) Gesamtproteingehalte von Mutanten- und Kontrollpflanzen, n = 9. (C) Auswirkungen von Trockenstress auf Proteingehalte von Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, Fehlerbalken geben die Standardabweichung an, n = 3. Unterschiedliche Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede bei P < 0,05 an. Groß-, Klein- oder Kleinkursivschrift weisen auf statistische Analysen hin, die in bestimmten Zeitintervallen durchgeführt werden.

Der Trockenstress senkte die SOD-Isoenzymwerte deutlich (Abb. 3A) und die Mutante Y35 wies den höchsten SOD-Wert auf (1,54 U/mg Protein) (Abb. 3B). Achtzehn Tage lang Trockenstress führten zu einem signifikanten Anstieg der SOD-Werte sowohl bei den Kontrollpflanzen als auch bei mutierten Im Gegensatz zu den Kontrollen und der Mutante X6 stiegen die SOD-Enzymspiegel am 24. Tag des Trockenstresses bei den Mutanten deutlich an (Abb. 3C).

Superoxiddismutase (SOD)-Isoenzymspiegel. (A) Gesamtauswirkungen von Trockenstress auf Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, n = 18. (B) Gesamt-SOD-Werte von Mutanten- und Kontrollpflanzen, n = 9. (C) Auswirkungen von Trockenstress auf SOD-Werte von Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, Fehlerbalken geben die Standardabweichung an, n = 3. Unterschiedliche Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede bei P < 0,05 an. Groß-, Klein- oder Kleinkursivschrift weisen auf statistische Analysen hin, die in bestimmten Zeitintervallen durchgeführt werden.

Die erste Trockenstressperiode (18 Tage) verringerte die TBARS-Werte (Abb. 4A), während keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zeiträumen vor dem Schneiden und am 24. Trockenstresstag festgestellt wurden (Abb. 4A). Die höchsten TBARS-Werte (3,80 und 3,36 nmol/g Protein) wurden von den Mutanten Y20 bzw. X6 erhalten, während die Mutante Y35 die niedrigsten (1,83 nmol/g Protein) aufwies (Abb. 4B). Die Mutante Y35 erhöhte den TBARS-Spiegel, als sich der Trockenstress vom 18. auf den 24. Tag verlängerte, während die Mutante Y30 ihn senkte (Abb. 4C). Im Allgemeinen wurde ein ähnliches Muster der TBARS-Werte bei den Kontrollen und Mutanten Y20 und

Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS)-Spiegel. (A) Gesamtauswirkungen von Trockenstress auf Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, n = 18. (B) Gesamt-TBARS-Werte von Mutanten- und Kontrollpflanzen, n = 9. (C) Auswirkungen von Trockenstress auf TBARS-Werte von Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, Fehlerbalken geben die Standardabweichung an, n = 3. Unterschiedliche Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede bei P < 0,05 an. Groß-, Klein- oder Kleinkursivschrift weisen auf statistische Analysen hin, die in bestimmten Zeitintervallen durchgeführt werden.

Die höchste APX-Enzymaktivität (0,17 U/mg Protein) wurde am 18. Tag des Trockenstresses im Vergleich zu den anderen getesteten Zeitintervallen ermittelt (Abb. 5A). Die APX-Aktivität war am höchsten (0,19 U/mg Protein) bei der Kontrolle Z2, während keine signifikanten Unterschiede zwischen der Mutante Y35 (0,148 U/mg Protein) und der Kontrolle Z1 (0,130 U/mg Protein) über die gesamten Zeiträume hinweg festgestellt wurden ( Abb. 5B). Die Mutante Y35 hatte im Vergleich zu den anderen Mutanten den höchsten APX-Gesamtspiegel (Abb. 5B). Die APX-Aktivität war bei der Mutante Y35 am höchsten, während beide Kontrollen zum Zeitpunkt vor dem Schneiden die niedrigste APX-Aktivität aufwiesen (Abb. 5C). Die APX-Enzymaktivität stieg am 18. Tag des Trockenstresses bei den Kontrollen und der Mutante Trockenstress (Abb. 5C). Mit Ausnahme der Mutante Y35 wurden bei den Kontroll- und Mutantenpflanzen am 24. Tag des Trockenstresses im Vergleich zum 18. Tag des Trockenstresses verringerte APX-Enzymaktivitätsniveaus festgestellt, obwohl die Mutante Y35 bei beiden Kontrollen das gleiche Niveau der APX-Enzymaktivität aufwies (Abb . 5C).

Aktivität des Enzyms Ascorbatperoxidase (APX). (A) Gesamtauswirkungen von Trockenstress auf Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, n = 18. (B) Gesamt-APX-Werte von Mutanten- und Kontrollpflanzen, n = 9. (C) Auswirkungen von Trockenstress auf APX-Werte von Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, Fehlerbalken geben die Standardabweichung an, n = 3. Unterschiedliche Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede bei P < 0,05 an. Groß-, Klein- oder Kleinkursivschrift weisen auf statistische Analysen hin, die in bestimmten Zeitintervallen durchgeführt werden.

Die GR-Werte stiegen während des Trockenstresses im Vergleich zu vor dem Schneiden deutlich an (Abb. 6A). Obwohl am Ende des Trockenstresses ein deutlicher Rückgang zu beobachten war, war der Gesamt-GR-Wert deutlich höher als vor der Schnittphase (Abb. 6A). Der höchste Gesamt-GR-Wert (0,098 (U/mg Protein)) wurde von der Kontrolle Z2 erhalten, während bei den Mutanten und der Kontrolle Z1 keine signifikanten Unterschiede festgestellt wurden (Abb. 6B). Signifikante Unterschiede wurden bei den GR-Werten der Kontrollen und mutierten Pflanzen festgestellt für alle angegebenen Zeiträume (Abb. 6C). Die bewässerte Kontrolle (Z1) ergab den niedrigsten GR-Wert vor dem Schneiden, während statistisch gesehen die gleichen GR-Werte bei der Kontrolle Z2 und den Mutanten ermittelt wurden (Abb. 6C). Achtzehnter Tag von Trockenstress erhöhte die GR-Spiegel sowohl in Kontroll- als auch in Mutantenpflanzen signifikant, mit Ausnahme der Mutante Y35, obwohl die GR-Menge bei den Mutanten relativ geringer war als bei den Kontrollpflanzen (Abb. 6C). Mit Ausnahme der Mutante X6 zeigten die Mutanten am 24. einen erhöhten GR-Spiegel Tag des Trockenstresses, während bei den Kontrollen im Vergleich zum 18. Tag des Trockenstresses ein verringerter GR-Gehalt festgestellt wurde (Abb. 6C). Ein ähnliches Muster des GR-Gehalts wurde bei den mutierten X6- und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeiträumen festgestellt (Abb. 6C).

Glutathionreduktase (GR)-Enzymaktivität. (A) Gesamtauswirkungen von Trockenstress auf Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, n = 18. (B) Gesamt-GR-Werte von Mutanten- und Kontrollpflanzen, n = 9. (C) Auswirkungen von Trockenstress auf GR-Werte von Mutanten und Kontrollpflanzen in bestimmten Zeitintervallen, Fehlerbalken geben die Standardabweichung an, n = 3. Unterschiedliche Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede bei P < 0,05 an. Groß-, Klein- oder Kleinkursivschrift weisen auf statistische Analysen hin, die in bestimmten Zeitintervallen durchgeführt werden.

Die MtP5CS-Genexpression zeigte große Variationen mit einem Anstieg um das 0,31-fache (X6) bis zum 4,71-fachen (Y30) am 18. Tag des Trockenstresses, obwohl die Expressionsniveaus am 18. Tag des Trockenstresses auf 0,03 (mutiertes Y30) und 1,14-fach (X6) sanken 24. Tag des Trockenstresses (Abb. 7A). Andererseits sanken die Expressionsniveaus des MtP5CS-Gens bei der Kontrollgruppe Z2 vom 18,6-fachen auf das 0,9-fache, wenn der Trockenstress von 18 auf 24 Tage verlängert wurde, während die Kontrollgruppe Z1 die Expressionsniveaus des gleichen Gens von 3,49-fach auf erhöhte 21,75-fach in den gleichen Zeitintervallen (Abb. 7A). Mit Ausnahme der Mutante

Relative Expressionsniveaus von auf Dürre reagierenden Genen in bestimmten Zeitintervallen (A–E) Veränderungen in der Expression von MtP5CS (Medicago truncatula Pyrrolin-5-Carboxylat-Synthetase) (A), MtDehyd (Medicago truncatula Dehydrin) (B), MseIF-2 (Medicago sativa eukaryotischer Translationsinitiationsfaktor 2) (C), MtRD2-Gene (Medicago truncatula Response to Desiccation 2) (D) und MsNAC-Gene (Medicago sativa NAC; NAM, ATAF und CUC2) (E) in Blattgeweben mutierter Luzernepflanzen. Als Referenzgen wurde Ms18s-rRNA (18S-ribosomale RNA) verwendet. Die gezeigten Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardfehler, n = 3. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede bei P < 0,05 hin.

Die Regulation von MtDehyd, auch bekannt als LEA-Gen (Late Embryogenesis reichlich), zeigte große Veränderungen als Reaktion auf Trockenstress, der nach dem ersten Schnitt im Knospenstadium angewendet wurde, und es wurde festgestellt, dass die Regulationsniveaus des verwandten Gens vom Genotyp abhängig waren (Abb. 7B). . Die Expression des MtDehyd-Gens am 18. Tag des Trockenstresses variierte vom 0,07-fachen (X6) bis zum 3,12-fachen (Y20) im Vergleich zum Referenzgen (Abb. 7B). Die MtDehyd-Genexpression nahm am 18. Tag des Trockenstresses bei den Mutanten X6, Y35 und Kontrollpflanzen Z2 signifikant ab, während bei den Mutanten Y20, Y230 und Kontrollpflanzen Z1 in den gleichen Zeitintervallen im Vergleich zu erhöhten Expressionsniveaus des gleichen Gens beobachtet wurden vor dem Schneiden (Abb. 7B). Die MtDehyd-Genexpression wurde bei der Kontrolle Z1 (vom 2,42-fachen auf das 39,23-fache) und der Mutante X6 (vom 0,07-fachen auf das 0,45-fache) hochreguliert, als der Trockenstress von 18 auf 24 Tage verlängert wurde (Abb. 7B).

Die Regulierung der MseIF-2-Genexpression variierte je nach mutiertem Genotyp und Dauer des Trockenstresses (Abb. 7C). Beispielsweise zeigten die Mutanten Y20, Y30 und Y35 am 18. Tag einen 1,26-fachen, 1,97-fachen und 1,71-fachen Anstieg des Trockenstresses, während dieser deutlich auf 0,38-fache, 0,04-fache und 0,25-fache Veränderungen zurückging jeweils am 24. Tag des Trockenstresses (Abb. 7C). Andererseits war die MseIF-2-Genexpression der Mutante Die Expressionsniveaus des MseIF-2-Gens stiegen bei beiden Kontrollpflanzen (Z1 und Z2) signifikant an, als sich der Trockenstress von 18 auf 24 Tage verlängerte, während bei Mutanten mit Ausnahme der Mutante X6 ein signifikanter Rückgang beobachtet wurde (Abb. 7C).

Die Verlängerung der Dauer des Trockenstresses von 18 auf 24 Tage führte zu einem signifikanten Rückgang der Expressionsniveaus des MtRD2-Gens bei den Mutanten Y20, Y30 und Y35, während es bei beiden Kontrollpflanzen (Z1 und Z2) zu einem signifikanten Anstieg führte (Abb. 7D). Die höchste (5,25-fach) und die niedrigste (0,09-fach) MtRD2-Genexpression wurden an der Mutante Y30 ermittelt, die am 18. bzw. 24. Tag des Trockenstresses betrachtet wurde (Abb. 7D).

Die MsNAC-Genexpression zeigte eine große Variabilität und das Ausmaß hat sich je nach Zeit und Dauer des Trockenstresses in den Kontroll- und Mutantenpflanzen verändert (Abb. 7E). Beispielsweise gab es bei der Kontrollpflanze Z1 am 18. Tag des Trockenstresses keinen signifikanten Unterschied, während bei der Kontrollpflanze Z2 im gleichen Zeitintervall ein 16,01-facher Anstieg festgestellt wurde (Abb. 7E). Die Expression des MsNAC-Gens zeigte eine signifikante Abnahme bei den Mutanten X6 (100,4-fach), Y20 (0,63-fach) und Y35 (0,55-fach), obwohl die Mutante Y30 am 18. Tag des Trockenstresses einen 1,44-fachen Anstieg zeigte (Abb . 7E). Bei der bewässerten Kontrollpflanze (Z1) wurde ein enormer Anstieg der MsNAC-Genexpression (177,32-fach) festgestellt, während bei der Mutante Y30 am 24. Tag des Trockenstresses im Vergleich zum Referenzgen ein starker Rückgang (100,70-facher Rückgang) beobachtet wurde (Abb. 7E).

Trockenstress kann einen erheblichen Ertragsverlust verursachen, dessen Ausmaß nicht nur von seiner Intensität und Schwere, sondern auch vom Entwicklungsstadium der Pflanze abhängt14. Wie bei vielen anderen wichtigen Nutzpflanzenarten ist die Samenkeimphase von Luzerne sehr anfällig für Trockenstress15. Daher werden neue Luzerne-Sorten benötigt, die Trockenstress im Keimungsstadium besser vertragen, um die Produktionsstabilität von Luzerne zu minimieren und sicherzustellen. Frühere Berichte zeigten, dass osmotische Substanzen mit hohem Molekulargewicht wie PEG einer der beliebtesten Ansätze für das Screening von Zielgenotypen bei der Keimung oder anderen Entwicklungsstadien vieler Pflanzen, einschließlich Luzerne, sind16. Es wurde auch über eine positive Korrelation zwischen der Keimung auf PEG-ergänzten Medien und dem Verhalten der gesamten Pflanze unter Wassermangelbedingungen im Feld berichtet17. Allerdings sollten die Labor-Screening-Methoden, die Wassermangel und Dürrestressbedingungen simulieren, zuverlässig für die Bestimmung wünschenswerter Genotypen erfolgreicher Zuchtprogramme sein18. Das Screening von 340675 M3-Samen in Gegenwart von mit 35 % PEG600 angereicherten Medien unter In-vitro-Keimungsbedingungen ergab mehrere dürretolerante Kandidaten, die ein sichtbares und messbares Keimwurzelwachstum zeigten, während bei den Kontrollsamen unter den gleichen Stressbedingungen keine Keimung beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass die Wurzel wächst Mithilfe des in der Studie verwendeten Wachstumstests und der Keimungsbedingungen konnten neuartige dürretolerante Mutanten ermittelt werden, die in der Lage waren, Zellteilung und -vergrößerung sowie Zelldifferenzierung durchzuführen (Abb. 1). Es ist bekannt, dass PEG aufgrund seines hohen Molekulargewichts die Zellwand nicht passieren kann und in der Lage ist, das Wasserpotential embryonaler Zellen zu regulieren, indem es einen schlechten Wasserfluss vom Xylem zu den nahegelegenen Zellen kontrolliert und den Prozess des Zellwachstums hauptsächlich aufgrund dieser begrenzt Verlust des Turgors19, was zu einer beeinträchtigten Zellverlängerung und einer Hemmung der Samenkeimung führt20. Die Keimungsvariation im simulierten Trockenstress mit PEG wurde auch für andere wichtige Nutzpflanzen berichtet, darunter Luzerne21, Klee16 und Weizen22.

Die Samenkeimung ist eine anfängliche, aber nicht nur Voraussetzung für die erfolgreiche Etablierung von Sämlingen für Trockenheitstoleranz, da Sämlinge, die Trockenstress ausgesetzt sind, während der Erholung möglicherweise nicht überleben oder einige Wachstumsstörungen in späteren Wachstumsstadien beibehalten23. Darüber hinaus sollten die Ergebnisse der im Labor simulierten Wasserstressbedingungen im Keimungsstadium unter realen Wasserdefizitbedingungen in verschiedenen Pflanzenwachstumsstadien bestätigt werden24. Daher haben wir 4 Mutantenkandidaten unter Wassermangelbedingungen, die 24 Tage lang direkt nach dem ersten Schnitt im Blütenknospenstadium etabliert wurden, weiter getestet. Die Ergebnisse der aktuellen Studie zeigten, dass die M3-Mutanten eine große Variation zeigten und sich die schädlichen Auswirkungen von Trockenstress auf die agromorphologischen Parameter sowohl auf der Grundlage des Mutantengenotyps als auch der Dauer des angewendeten Trockenstresses veränderten (Tabelle 1). Alle Mutanten zeigten in den angegebenen Zeitintervallen eine bessere Nachwuchsleistung und vertrugen Trockenstressbedingungen besser als unbewässerte Kontrollpflanzen (Z2), was darauf hindeutet, dass die Abnahme der Photosynthese und die Verfügbarkeit von Photoassimilaten unter Trockenstressbedingungen bei Mutanten im Vergleich zu Kontrollpflanzen begrenzt war (Tabelle 1). Frühere Berichte zeigten, dass Wasserstress die Anzahl der Blätter und die Blattgröße verringerte und zu einer geringeren Biomasse bei Luzerne führte, obwohl die Anzahl der Seitenzweige insbesondere unter schweren Dürrebedingungen zunahm25, was mit den entsprechenden Ergebnissen dieser Studie übereinstimmte (Tabelle 1). Als Hauptgründe für die verringerte Pflanzenblattfläche unter Trockenstress wurden der verringerte Blattturgordruck, die Blätterdachtemperatur und die Verfügbarkeit von Photoassimilaten aufgrund der Abnahme der Photosyntheserate unter Trockenstressbedingungen angesehen26. Die Stomata-Einschränkung erwies sich als einer der Hauptfaktoren für eine verminderte Photosyntheserate unter milden Dürrebedingungen, obwohl sich nicht-stomatäre Faktoren wie eine verminderte Photosynthese als Hauptursache für den Rückgang der Photosyntheserate unter schweren Dürrebedingungen erwiesen26.

Starker Trockenstress verringert den Heuertrag und den Rohproteingehalt (CP) und erhöht die Ballaststoffe, was die Verdaulichkeit des Grases in der Luzerne verringert, obwohl die Auswirkungen von Trockenstress auf den Ertrag und die Zusammensetzung der Luzerne je nach Luzerne-Sorte unterschiedlich sein können27. Frühere Berichte deuteten darauf hin, dass Trockenstress das Verhältnis von CP zum Anteil an wasserlöslichen Kohlenhydraten verringerte, was den N-Überschuss bei Wiederkäuern verringern könnte27. Im Gegensatz zu den Proteingehalten sowohl der bewässerten (Z1) als auch der unbewässerten Kontrollpflanzen (Z2) erhöhte Trockenstress den Proteingehalt der Mutanten Y20 und Y30, während er sich bei der Mutante Y30 nicht veränderte (Abb. 2). Diese Ergebnisse legen nahe, dass EMS verschiedene Arten von Punktmutationen im Luzerne-Genom verursacht hat und dass der Proteinbiosyntheseweg der Mutanten im Vergleich zu den Kontrollen anders als Reaktion auf Trockenstress reguliert ist. Da ein hoher Proteingehalt für die Tierernährung unter Trockenstressbedingungen von entscheidender Bedeutung ist, können die in dieser Studie ermittelten neuen Mutanten als wichtige Ressource für die Entwicklung neuer dürretoleranter Luzernesorten in Zuchtprogrammen genutzt werden.

Trockenstress führt zunächst zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die oxidative Schäden verursachen, indem sie die Funktion von Lipiden und Proteinen in den Zellen verhindern28. Um die schädlichen Auswirkungen von Trockenstress zu verhindern oder zu verringern, nutzen Pflanzen entweder ein enzymatisches oder nicht-enzymatisches antioxidatives Abwehrsystem29, wobei das enzymatische Abwehrsystem allgemein als das wirksamste angesehen wird30. Antioxidative Enzyme verhindern, dass natürlich vorkommende ROS, die als Folge der Stoffwechselaktivitäten der Zellen entstehen, subzelluläre Strukturen schädigen28. Es ist bekannt, dass die ROS-Produktion auch als Reaktion auf Trockenstress zunimmt28 und antioxidative Enzyme wie APX, GR und SOD spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Entgiftung von ROS und schützen die Zelle vor möglichen Schäden, die bei erhöhten ROS31 auftreten können. Dürretolerante Luzerne und einige andere Hülsenfruchtpflanzen werden toleranter gegenüber den negativen Auswirkungen von Dürre und Salzstress, indem sie ihre antioxidativen Enzymaktivitäten erhöhen 32. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass sich die SOD-, APX- und GR-Gehalte der Mutanten deutlich von denen der unbewässerten Kontrolle unterscheiden (Z2) (Abb. 3, 5, 6). Beispielsweise nahmen die SOD-Enzymaktivitäten am 18. Tag des Trockenstresses ab, während die gleiche Enzymaktivität am 24. Tag des Trockenstresses bei den Mutanten Y20, Y30 und Y35 im Vergleich zu den Kontrollen und dem Mutanten X6 zunahm (Abb. 3). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine verringerte SOD-Enzymaktivität am 18. Tag des Trockenstresses bei bestimmten Mutanten möglicherweise nicht direkt mit Trockenstress an sich zusammenhängt, sondern mit schneidenden Effekten im Stadium der Blütenknospen (Abb. 3). Es ist auch möglich, dass die Mutanten den Trockenstress später wahrnehmen als die Kontrollpflanzen, und ein erhöhter Grad der SOD-Enzymaktivität am 24. Tag des Trockenstresses deutet auf eine verbesserte Trockenheitstoleranz der Mutanten aufgrund der zufälligen Punktmutation des EMS-Mutagens hin (Abb . 3).

Der TBARS ist einer der häufigsten Parameter zum Nachweis der Lipidoxidation als Reaktion auf Stress1. Das MDA ist ein Spaltprodukt eines Endoperoxids ungesättigter Fettsäuren und reagiert mit Thiobarbitursäure (TBA) unter Bildung von TBARS33. Anhaltender Trockenstress erhöhte die TBARS-Werte bei den Mutanten X6 und Y20, während bei den Mutanten Y30, Y35 und der unbewässerten Kontrolle (Z2) ähnliche TBARS-Werte ermittelt wurden, was darauf hindeutet, dass die MDA-Akkumulation und die damit verbundenen Enzymaktivitäten bei den verglichenen Mutanten X6 und Y20 unterschiedlich reguliert sein könnten zu den anderen Mutanten6 oder es treten erhebliche Mängel auf, wenn es zur Beurteilung der Lipidperoxidation bei den verwandten Mutanten verwendet wird34. APX und GR sind die Schlüsselenzyme für den Ascorbat-Glutathion-Zyklus (AsA-GSH) und verhindern die Ansammlung eines toxischen H2O2-Spiegels in photosynthetischen Organismen unter Stressbedingungen35. Obwohl gezeigt wurde, dass die APX- und GR-Aktivitäten unter verschiedenen Stressbedingungen, einschließlich Dürre, bei verschiedenen Pflanzenarten ansteigen32, waren diese Enzymaktivitäten bei den Mutanten in dieser Studie deutlich geringer als bei beiden Kontrollpflanzen, was darauf hindeutet, dass oxidative Schäden überhaupt nicht auftraten die Mutanten oder hatten bei Mutanten im Vergleich zu Kontrollpflanzen weniger schädliche Auswirkungen.

Die transkriptionellen und posttranskriptionellen Niveaus der mit abiotischem Stress in Zusammenhang stehenden Gene in Pflanzen ändern sich unter Wassermangelbedingungen36. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass das Expressionsmuster der dürrebedingten MtP5CS-, MtDehyd-, MseIF-2-, MtRD2- und MsNAC-Gene bei den Mutanten im Vergleich zu Kontrollpflanzen unterschiedlich reguliert wurde (Abb. 7). Das Vorliegen einer Herunterregulierung aller Gene konnte bei der Mutante ). Das Expressionsniveau des MtP5CS-Gens am 18. Tag des Trockenstresses war bei den Mutanten signifikant niedriger als bei der Kontrollgruppe Z2, mit Ausnahme der Mutante X6, während anhaltender Trockenstress eine Herunterregulierung desselben Gens verursachte (Abb. 7). Die Expressionsniveaus der MtDehyd-, MseIF-2- und MtRD2-Gene am 18. Tag des Trockenstresses waren bei den Mutanten Y20, Y30 und Y35 hochreguliert, obwohl die Kontrolle Z2 im gleichen Zeitintervall ein niedrigeres Expressionsniveau aufwies als die Mutanten (Abb. 7). . Andererseits verursachte anhaltender Trockenstress (24 Tage) eine starke Herunterregulierung der MtDehyd-, MseIF-2- und MtRD2-Gene auf den Mutanten, obwohl die Kontrolle Z2 kein oder ein geringeres Expressionsniveau als die Mutanten aufwies (Abb. 7). Bei den Mutanten wurden in beiden Zeitintervallen (18 Tage und 24 Tage) sowohl Herab- als auch Heraufregulierungen der MsNAC-Genexpression beobachtet, während das gleiche Gen in bestimmten Zeitintervallen auf unbewässerten Kontrollpflanzen (Z2) signifikant hochreguliert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mutanten unterschiedliche Wirkungsweisen als Reaktion auf Trockenstress haben und dass die Transkriptionsregulationen der in dieser Studie getesteten Gene, die mit Trockenheit in Zusammenhang stehen, einen frühen Alarm auslösten, so dass Mutanten im Vergleich zur Kontrolle toleranter gegenüber anhaltendem Trockenstress werden. Die Ergebnisse dürrebedingter Genexpressionen zeigten auch eine Übereinstimmung mit den Enzymaktivitäten, die bei den Mutanten am 18. Tag des Dürrestresses ermittelt wurden (Abb. 7), mit Ausnahme von TBARS. Kontrollpflanzen zeigten am 18. Tag des Trockenstresses höhere SOD-, APX- und GR-Enzymaktivitäten als die Mutanten, während die Mutanten Y20 und Y30 am 24. Tag des Trockenstresses geringere Werte an APX- und GR-Enzymen aufwiesen als die Kontrollpflanzen (Abb. 7). . Diese Ergebnisse legen nahe, dass die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulation der Mutanten im Vergleich zu den Kontrollen eine einzigartige Wirkungsweise als Reaktion auf bestimmte Dürrestressbedingungen aufweist.

Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse dieser Studie, dass durch das Screening von M3-Luzernesamen in einem Wurzelwachstumstest, ergänzt mit 35 % PEG600, neuartige dürretolerante Mutanten ermittelt werden konnten, die auch Wassermangelbedingungen tolerierten, die 24 Tage nach dem ersten Schnitt an der Blütenknospe angewendet wurden Bühne. Allerdings sollten die in dieser Studie ermittelten neuartigen dürretoleranten Luzerne-Genotypen unter Feldbedingungen weiter auf Heuertrag, Nährstoffqualität, Fähigkeit zur Stickstofffixierung und Nachhaltigkeit untersucht werden.

Wir bestätigen, dass die experimentelle Forschung und die Feldstudien an Pflanzen (entweder kultiviert oder mutiert), einschließlich der Sammlung von Pflanzenmaterial, auf der Grundlage der Einhaltung relevanter institutioneller, nationaler und internationaler Richtlinien und Gesetze durchgeführt wurden. Die 200-g-Samen (das Tausendsamengewicht beträgt etwa 2 g) der Luzerne-Sorte (Medicago sativa L.) Bilensoy-80 wurden 12 Stunden lang mit 0,15 % Ethylmethansulfonat (EMS) mutagenisiert, wie in der Literatur angegeben37,38. Aus den im Freiland angebauten M1-Pflanzen wurden etwa 470 g M2-Samen gewonnen. Die M2-Samen wurden mit einer Rohfläche von 70 cm gepflanzt. Die M2-Pflanzen wurden im frühen Knospenstadium mit einem Isolierbeutel isoliert und zur Selbstbestäubung belassen, die während der Blütezeit etwa einen Monat lang fortgesetzt wurde. Die Schoten dieser Pflanzen wurden von Hand geerntet und manuell entsorgt. Insgesamt 340.675 M3-Samen wurden für das In-vitro-Screening mithilfe des unten angegebenen Wurzelwachstumstests verwendet.

Die M3-Samen wurden 10 Minuten lang mit reinem Ethanol behandelt, dann 20 Minuten lang in einer Lösung mit HCl (0,5 ml/100 ml) und HgCl2 (0,2 g/100 ml) gehalten und dann 5x mit sterilem dH2O gewaschen. Halbstarkes MS-Medium mit 5 g/L Saccharose, 1 % Agar und 2 mM MES-Puffer mit pH 5,7 wurde unter aseptischen Bedingungen in Einweg-Petrischalen (steril, 3 × 15 cm) aus Kunststoff gegossen und abkühlen gelassen. Um Trockenstress zu induzieren, wurde 35 % PEG mithilfe der Infiltrationsmethode auf das verfestigte MS-Medium halber Stärke gegeben (Abb. 1)2,39. Als Kontrolle dienten die Samen der Sorte Bilensoy-80 (Abb. 1B). Mit porösem 3 M Micropore-Klebeband abgeklebte Petrischalen wurden 48 Stunden lang bei 4 °C gehalten, um eine mögliche Keimruhe zu unterbrechen. Anschließend wurden die Petrischalen unter konstanten dunklen Bedingungen für 3 Tage bei 25 °C und weitere 4 Tage bei 25 °C in aufrechter Position in einer kontrollierten Pflanzenwachstumskammer mit 12-stündigem Licht (350 µmol m−2 s) inkubiert −1)/Dunkelzyklus15,39.

Die gekeimten Samen, die eine gute Wurzelverlängerung aufwiesen, wurden als dürretolerante Mutantenkandidaten identifiziert (Abb. 1C, D), mit einer Pinzette aus den Petrischalen entnommen und auf Violen (5 × 5 cm) übertragen, die mit einer Torf-Perlit-Mischung gefüllt waren ( 3:1 v/v) (Abb. 1E). Die Violen wurden 14 Stunden lang Licht (350 µmol m−2 s−1) ausgesetzt, bis die ersten echten Kleeblätter sichtbar waren (Abb. 1F), bei Wachstumsbedingungen von 20 °C und 65 % Luftfeuchtigkeit. Die Sämlinge, die die ersten echten Blätter zeigten (drei Blättchen, 7–10 cm Keimlingshöhe), wurden dann in die Töpfe (30 cm × 30 cm) überführt, die eine Torf-Perlit-Mischung (3:1 v/v) enthielten (Abb. 1G). Die Pflanzen wurden bis zum Knospenstadium unter bestimmten Wachstumsbedingungen wie zuvor beschrieben gezüchtet (Abb. 1H).

Die Kandidatenmutanten wurden unter Wassermangelbedingungen, die 24 Tage nach dem ersten Schnitt im Knospenstadium angewendet wurden, erneut bewertet. Die M3-Mutanten wurden unter vorgegebenen Bedingungen wie zuvor beschrieben gezüchtet, bis die ersten Blütenknospen des Hauptstamms sichtbar waren, und wurden in einer Höhe von 5 cm abgeschnitten (Abb. 1H). Anschließend wurden die Töpfe bewässert, bis sie die Feldwasserkapazität erreichten, und dann 24 Stunden stehen gelassen, damit das Wasser abfließen konnte6,40. Diese Töpfe wurden insgesamt 24 Tage lang nicht bewässert und die Blattproben wurden am 0. (Kontrolle, vor dem Schnitt), am 18. und 24. Tag des Trockenstresses entnommen und sofort bei –80 °C gelagert, bis sie für physiologische und physiologische Zwecke verwendet wurden molekulare Analyse. Die agromorphologischen Parameter wurden auch in bestimmten Zeitintervallen von Trockenstress bestimmt und die Ergebnisse mit bewässerten (Z1) und unbewässerten (Z2) Kontrollen verglichen6.

Am 18. und 24. Tag des Trockenstresses wurden die Hauptstammlänge, die Hauptstammdicke, die Anzahl der Zweige, die Anzahl der Blätter, die Länge und Breite des mittleren Blättchens sowie die Temperaturen im Pflanzendach bestimmt. Fünf zufällig ausgewählte Schoten jeder Pflanze wurden verwendet, um den Samenertrag pro Schote zu bestimmen, und die Menge der von jeder Pflanze erhaltenen M4-Samen (g/Pflanze) wurde bestimmt. Die Hauptstammdicke wurde zwischen dem 2. und 3. Ast des Hauptstammes durch Messung mit einer 0,1 mm Teilungslehre ermittelt. Die Länge und Breite der mittleren Blättchen wurde aus dem 4. und 5. Blatt des Haupttriebs bestimmt6. Vor der Entnahme von Blattproben wurden die Pflanzentemperaturen mit einem lasermarkierten Infrarot-Thermometer (IR988) an drei verschiedenen Punkten im unteren, mittleren und oberen Teil jeder Pflanze bestimmt.

Die vorhandenen Gewebe am 0. (Kontrolle, vor dem Schnitt), 18. und 24. Tag der Belastung wurden zur Bestimmung des Proteingehalts, des Superoxiddismutase (SOD)-Isoenzyms und der Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS)-Spiegel, des Ascorbatperoxidase (APX)-Enzyms und verwendet Glutathionreduktase (GR)-Enzymaktivitäten mit drei biologischen Replikationen.

Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an löslichem Protein wurde der Rinderserumalbumin (BSA)-Standard nach der Bradford-Methode verwendet41. Der Gehalt des nach dieser Methode gebildeten Thiobarbuttersäure (TBA)-MDA-Komplexes wurde bei A532 und A600 nm im Spektrophotometer bestimmt. Der MDA-Gehalt in Geweben wurde anhand der folgenden Formel berechnet: MDA-Gehalt = [(A532 – A600) × Extraktvolumen (ml)]/[155 mM/cm × Probenmenge (mg)]. Die SOD-Enzymaktivität wurde spektrophotometrisch bei 560 nm nach der Methode bestimmt, die auf der photochemischen Reduktion von Nitroblautetrazolium (NBT)42 basiert. Die APX-Enzymaktivität wurde anhand der angegebenen Literatur43 bestimmt. Die gesamte APX-Enzymaktivität in Geweben wurde aus der Anfangsrate (nmol.ascorbat.min−1.mg Protein−1) unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von Ascorbat (2,8 mM.cm−1) berechnet. Die GR-Enzymaktivität wurde wie in der Literatur angegeben44 durchgeführt. Die gesamte GR-Enzymaktivität der Proben wurde aus der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeit (nmolNADPH.min−1.mg Protein−1) nach Abzug der nichtenzymatischen Oxidation unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von NADPH (6,2 mM cm−1) berechnet.

Die vollständige RNA-Isolierung der Blattproben wurde mithilfe des kommerziellen RNA-Extraktionskits (Vivantis GF-1) gemäß dem vom Unternehmen angegebenen Protokoll durchgeführt. Die Qualität isolierter RNAs wurde durch spektroskopische Messung bei 260/280 nm mit einem Nanodrop-Gerät bestimmt und auch auf 2 % Agarosegel unter Verwendung eines speziellen Gelelektrophoresesystems bestätigt, um verschiedene enzymatische Kontaminationen zu verhindern (ergänzende Abbildung 1).

Erststrang-cDNAs wurden mit 4 µl Gesamt-RNA RevertAid Erststrang-cDNA-Synthesekit (Thermo Fisher Scientific, USA) synthetisiert. Expressionsunterschiede spezifischer Gene für Trockenstress wurden durch RT-qPCR (StepOne 7500, Applied Bioscience) unter Verwendung der relevanten genspezifischen Primer nachgewiesen (Ergänzungstabelle 1). Die Primer aller Gene wurden vor der RT-qPCR-Analyse getestet, um die optimalen Bindungstemperaturen und den Amplikonstatus zu bestimmen. Darüber hinaus wurden auch die Spezifitäten der Primer und PCR-Produkte getestet und durch Schmelzkurvenanalysen bestätigt, die am Ende der RT-qPCR-Analyse durchgeführt wurden. Die RT-qPCR-Bedingungen wurden 15 Minuten lang bei 95 °C angewendet, gefolgt von 40 Zyklen mit 40 Sekunden lang 95 °C, 40 Sekunden lang 55 °C und 30 Sekunden lang 72 °C. Am Ende der PCR-Reaktion wurde die Schmelzkurvenanalyse bei 58–92 °C durchgeführt. Am Ende des Experiments wurde eine Analyse der Dissoziationskinetik durchgeführt, um die Spezifität des Annealings zu überprüfen.

Als Housekeeping-Gene wurden in den RT-qPCR-Analysen gleichzeitig die Referenzgene Ms18srRNA und MsActin getestet6,45. Da festgestellt wurde, dass das Ms18srRNA-Gen stabiler ist und weniger Variationen zwischen technischen Wiederholungen aufweist, wurde es als interne Kontrolle bei den RT-qPCR-Amplifikationen verwendet und die Ergebnisse mit der 2-Delta-Delta-Ct-Methode verglichen46. Bei allen qPCR-Experimenten wurden die MIQE-Richtlinien befolgt47.

Die Genexpressionsniveaus wurden an den Blattgeweben bestimmt, die am 0. (Kontrolle, vor dem Schnitt), 18. und 24. Tag des Trockenstresses mit 3 technischen Replikationen entnommen wurden. Zur Bestimmung der kritischen Schwellenwerte (Ct) der Amplifikate wurden die im Handbuch des Gerätes (StepOne 7500, Applied Bioscience) empfohlenen Einstellungen verwendet. Die Delta-Ct-Standardabweichungswerte unter den technischen Replikationen ≥ 0,25 wurden wiederholt. Bei den Berechnungen der relativen Menge (2-Delta-Delta-Ct) wurde der RQ-Wert (Relative Quantifizierung) in der Kontrollgenexpression mit 1 und mehr als dem Zweifachen oder weniger als dem 0,5-fachen der Expressionsänderungen der Proben angenommen wurden bei der Interpretation der Ergebnisse verwendet. Darüber hinaus wurde bei der Erstellung von Genexpressionsdiagrammen ein logarithmisches Indikatordiagramm verwendet, insbesondere um die Expressionsänderungen zu sehen, die weniger als das 0,5-fache im Vergleich zum Referenzgen betragen.

Die agromorphologischen Daten (mittlere Blattlänge und -breite, Temperaturen des Pflanzendachs und Anzahl der Samen pro Schote) wurden einer einfaktoriellen ANOVA unter Verwendung des SAS-Paketprogramms48 unterzogen. Die physiologischen Parameter wurden gemäß den Methoden in den relevanten Referenzen analysiert, die im Methodenteil angegeben sind. Die Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Daten wurden mit dem LSD-Test auf dem Niveau P < 0,05 getestet. Die molekularen Daten wurden gemäß der 2-Delta-Delta-Ct-Methode unter Verwendung des Ms18srRNA-Gens als interne Kontrolle normalisiert und die Expressionsniveaus der relevanten Gene bestimmt46,49. Die signifikanten Unterschiede auf dem Niveau p < 0,05 wurden mit unterschiedlichen Buchstaben über den Zahlenspalten angegeben.

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Die finanzielle Unterstützung dieser Studie wurde vom Wissenschaftlichen und Technologischen Forschungsrat der Türkei (TUBITAK) mit dem Forschungsstipendium TOVAG-116O417 bereitgestellt. Wir möchten Dr. Melih Taskin danken, der uns die Verwendung von RT-qPCR ermöglicht hat. Wir möchten uns auch bei Huseyin Keles und Semun Tayyar für ihre Hilfe bei der Ernte bzw. Selbstbefruchtung auf dem Feld bedanken. Wir möchten auch Enes Gokhan Yilmaz, Beste Celep, Erman Cavusoglu und anonymen Labormitgliedern danken, die bei den Laborexperimenten und dem Mutantenwachstum unter Kontrollbedingungen geholfen haben.

Abteilung für Agrarbiotechnologie, Fakultät für Landwirtschaft, Canakkale Onsekiz Mart University, Terzioglu Campus, 17000, Canakkale, Türkei

Iskender Tiryaki, Ugur Sari und Selcuk Cetin

Fachbereich Biologie, Fakultät für Künste und Wissenschaften, Canakkale Onsekiz Mart University, 17100, Canakkale, Türkei

Okan Acar

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IT konzipierte die Idee, gewährte finanzielle Unterstützung, plante die Experimente, führte die Analyse durch, interpretierte die Daten, entwarf die Abbildungen und verfasste das Manuskript. In den USA konzipiertes Screening und RT-qPCR-Analyse. SC sammelte Daten zu agromorphologischen Parametern und leistete technische Unterstützung während der Forschung und OA führte Enzymanalysen durch. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Iskender Tiryaki.

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tiryaki, I., Sari, U., Cetin, S. et al. Verbesserte Dürretoleranz von EMS-mutagenisierten Alfalfa-Mutanten (Medicago sativa L.) durch In-vitro-Screening im Keimungsstadium. Sci Rep 12, 12693 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16294-0

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Eingegangen: 15. Februar 2022

Angenommen: 07. Juli 2022

Veröffentlicht: 26. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16294-0

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